Sema4D在乙型肝炎肝硬化患者外周血T淋巴细胞和血清中的表达及意义

温雪 何昱静 袁倩倩 李初谊 卢利霞 于晓辉 张久聪

摘要：目的 研究乙型肝炎肝硬化患者外周血T淋巴細胞和血清中Sema4D的表达，分析其与临床指标的相关性。方法 纳入2020年10月—2021年11月在联勤保障部队第九四〇医院就诊的20例慢性乙型肝炎（CHB）患者，68例乙型肝炎肝硬化患者以及20例健康对照者。根据Child-Pugh分级标准将乙型肝炎肝硬化患者分为Child-Pugh A级组（n=24）、B级组（n=24）和C级组（n=20）。采集患者外周血，分离血清及外周血单个核细胞（PBMC），流式细胞术检测PBMC中膜结合型Sema4D（mSema4D）+CD4+T、mSema4D+CD8+T淋巴细胞的表达，酶联免疫吸附实验检测血清中可溶型Sema4D（sSema4D）的表达，分析其与病毒复制、肝脏炎症指标的相关性。符合正态分布的计量资料多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；非正态分布的计量资料多组间比较用Kruskal-Wallis H检验，进一步两两比较采用Mann-Whitney U检验；采用Spearman进行相关性分析。结果 mSema4D+CD4+T、mSema4D+CD8+T淋巴细胞的表达在CHB组、乙型肝炎肝硬化组和对照组3组间比较差异均有统计学意义（F值分别为43.092、13.344，P值均＜0.001），进一步两两比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。随着Child-Pugh分级的增加，mSema4D+CD4+T淋巴细胞、mSema4D+CD8+T淋巴细胞的表达水平逐渐降低（F值分别为14.093、17.154，P值均＜0.05），进一步两两比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。对照组、CHB组、乙型肝炎肝硬化组sSema4D含量分别为1.54（1.42～1.71）ng/mL、1.08（1.07～1.38）ng/mL、4.87（2.13～14.97）ng/mL，3组间比较差异有统计学意义（H=32.366，P＜0.001），进一步两两比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。Child-Pugh A级组、B级组、C级组sSema4D含量分别为2.42（0.59～5.65）ng/mL、4.92（2.75～12.73）ng/mL、14.18（4.59～18.43）ng/mL，3组间比较差异有统计学意义（H=11.889，P=0.003），进一步两两比较差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。sSema4D水平与乙型肝炎肝硬化患者的ALT、HBV DNA定量的表达水平均呈明显正相关（r值分别为0.294、0.430，P值均＜0.05）。结论 Sema4D 在乙型肝炎肝硬化患者T淋巴细胞膜上低表达，在血清中高表达。sSema4D可能通过影响乙型肝炎肝硬化患者的ALT、HBV DNA水平，参与疾病的发生发展。

关键词：肝硬化； 乙型肝炎； Sema4D； T淋巴细胞

基金项目：国家自然科学基金（青年基金）（81500454）； 甘肃省科技计划项目（21JR7RA017）；  甘肃省消化系统重症疾病临床医学研究中心（20JR10RA107）

Expression of Sema4D in peripheral blood T cells and serum of patients with hepatitis B cirrhosis and its clinical significance

WEN Xue1，2， HE Yujing1， YUAN Qianqian1， LI Chuyi1， LU Lixia1， YU Xiaohui1， ZHANG Jiucong1. （1. Department of Gastroenterology， The 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army， Lanzhou 730050， China; 2. School of Clinical Medicine， Ningxia Medical University， Yinchuan 750000， China）

Corresponding authors：

YU Xiaohui， yuxiaohui528@126.com （ORCID：0000-0002-8633-3281）;

ZHANG Jiucong， zhangjiucong@163.com （ORCID：0000-0003-4006-3033）

Abstract：

Objective To investigate the expression of Sema4D in peripheral blood T cells and serum of patients with hepatitis B cirrhosis and its correlation with clinical indicators. Methods A total of 20 patients with chronic hepatitis B （CHB）， 68 patients with hepatitis B cirrhosis， and 20 healthy controls who attended The 940th Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese Peoples Liberation Army from October 2020 to November 2021 were enrolled. According to Child-Pugh class， the patients with hepatitis B cirrhosis were divided into Child-Pugh class A group with 24 patients， Child-Pugh class B group with 24 patients， and Child-Pugh class C group with 20 patients. After peripheral blood samples were collected to isolate serum and peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）， flow cytometry was used to measure the expression of membrane-bound Sema4D （mSema4D）+CD4+ T cells and mSema4D+CD8+ T cells in PBMCs， and ELISA was used to measure the expression of soluble Sema4D （sSema4D） in serum; their correlation with viral replication and liver inflammation markers was analyzed. A one-way analysis of variance was used for comparison of normally distributed continuous data between multiple groups， and the    least significant difference t-test was used for further comparison between two groups; the Kruskal-Wallis H test was used for comparison of non-normally distributed continuous data between multiple groups， and the   Mann-Whitney U  test was used for further comparison between two groups; a Spearman correlation analysis was also performed. Results There were significant differences in the expression of mSema4D+CD4+ T cells and mSema4D+CD8+ T cells between the CHB group， the hepatitis B cirrhosis group， and the control group （F=43.092 and 13.344， both P＜0.001）， while there were significant differences between any two groups （P＜0.05）. The expression levels of mSema4D+CD4+ T cells and mSema4D+CD8+ T cells gradually decreased with increasing Child-Pugh class （F=14.093 and 17.154， both P＜0.05）， and there were significant differences between any two groups （P＜0.05）. The content of sSema4D was 1.54（1.42-1.71） ng/mL in the control group， 1.08（1.07-1.38） ng/mL in the CHB group， and 4.87（2.13-14.97） ng/mL in the hepatitis B cirrhosis group， with a significant difference between the three groups （H=32.366， P＜0.001） and between any two groups （P＜0.05）. The content of sSema4D was 2.42（0.59-5.65） ng/mL in the Child-Pugh class A group， 4.92（2.75-12.73） ng/mL in the Child-Pugh class B group， and 14.18（4.59-18.43） ng/mL in the Child-Pugh class C group， with a significant difference between the three groups （H=11.889， P=0.003） and between any two groups （P＜0.05）. In patients with hepatitis B cirrhosis， the level of sSema4D was positively correlated with the levels of alanine aminotransferase （ALT） and HBV DNA quantification （r=0.294 and 0.430， both P＜0.05）. Conclusion Sema4D is lowly expressed on T cell membrane and highly expressed in serum of patients with hepatitis B cirrhosis， and sSema4D may be involved in the development and progression of hepatitis B cirrhosis by affecting the levels of ALT and HBV DNA.

Key words：Liver Cirrhosis； Hepatitis B； Sema4D； T-Lymphocytes

Research funding：

National Natural Science Foundation of China （Youth Foundation）（81500454）; Science and Technology Program of Gansu Province（21JR7RA017）; Gansu Provincial Clinical Research Center for Severe Disease of Digestive System（20JR10RA107）

HBV持续感染所致的乙型肝炎肝硬化是目前我国肝硬化的主要原因［1］。机体免疫功能紊乱参与了乙型肝炎肝硬化的发生发展，但其具体机制还没有完全阐明。Semxpahorin 4D（Sema4D），又称为CD100，是一种跨膜型的二聚体蛋白，主要存在于静息的T淋巴细胞，在B淋巴细胞、抗原递呈细胞等细胞膜上也可表达［2-3］。某些基质金属蛋白酶（matrix metallopeptidases，MMP）可以通过水解Sema4D胞外区的蛋白，介导Sema4D从细胞膜表面脱落，形成具有生物学活性的可溶型Sema4D（soluble Sema4D，sSema4D）［4］。Sema4D可以与受体分化抗原簇72（CD72）和神经丛蛋白B（Plexin-B），包括Plexin-B1和Plexin-B2结合，在病毒感染性疾病、炎性疾病、肿瘤等多种疾病的发生中起着重要的作用［5-7］。由于肝硬化是慢性乙型肝炎（CHB）进展的重要阶段，两者关系密切，互为因果。因此，本试验以CHB患者、乙型肝炎肝硬化患者和健康体检者为研究对象，采集其外周静脉血，运用流式细胞术及酶联免疫吸附试验（ELISA）等实验方法，检测CHB患者、乙型肝炎肝硬化患者和健康体检者Sema4D在外周血T淋巴细胞及血清中的表达水平，并探讨二者相关关系，初步揭示Sema4D在乙型肝炎肝硬化疾病进程中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2020年10月—2021年11月在联勤保障部队第九四○医院就诊的20例CHB患者、68例乙型肝炎肝硬化患者及20例健康对照者。诊断标准按中华医学会感染病学分会、肝病学分会发布的《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》执行［8］。根据Child-Pugh分级标准将乙型肝炎肝硬化患者分为Child-Pugh A级组（n=24）、B级组（n=24）、C级组（n=20）。纳入标准：（1）患者至少3个月未使用抗病毒药物或相关免疫抑制药物治疗；（2）所有受试者年龄18～80岁；排除标准：（1）合并HAV、HCV等嗜肝病毒或其他病毒感染的患者；（2）合并自身免疫、酒精、药物、代谢、遗传等多种原因引起的肝硬化的患者；（3）合并自身免疫及严重的其他系统疾病的患者；（4）合并肝癌的患者；（5）妊娠或哺乳期女性；（6）在过去3个月内接受抗病毒或免疫抑制治疗的患者；（7）临床资料不全者。对照组人群均无慢性病史。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集 对所有入选的患者采集空腹肘静脉血6 mL，其中2 mL注射入不含抗凝剂的采血管中，4 mL血液注射入肝素钠抗凝管中用于分离血清及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。

1.2.2 流式细胞术检测PBMC中T淋巴细胞亚群及其表面膜结合型Sema4D（membrane-bound Sema4D， mSema4D）的表达 将-80 ℃冰箱冻存的外周血PBMC复苏，设置空白对照管、单阳管、同型对照管、样本管，分别加入CD3、CD4、CD8、Sema4D单克隆抗体，将细胞处理后用美国BD公司的流式细胞仪进行测定。

1.2.3 外周血血清中sSema4D的检测 采用ELISA实验方法，试剂盒由上海江莱生物科技有限公司提供，严格按照说明书检测步骤进行。

1.2.4 患者ALT、HBV DNA定量的检测 所有入组患者均采用全自动生化分析仪检测ALT水平，RT-PCR法检测HBV DNA定量。实验过程中所需设备及耗材均来自本院检验科。

1.3 统计学方法 采用SPSS 26.0软件分析数据。正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；非正态分布的计量资料以M（P25～P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，进一步两两比较采用Mann-Whitney U檢验；采用Spearman进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 T淋巴细胞亚群的检测 各组间性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P值均＞0.05）。对照组、CHB组、乙型肝炎肝硬化组患者CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞的百分比呈逐渐下降的趋势，各组间比较均有统计学意义（P值均＜0.05）（表1）。

2.2 Sema4D在受试者外周血CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞膜上的表达 流式细胞术检测受试者外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞膜上Sema4D的表达。结果显示，与对照组相比，CHB组患者CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞膜上Sema4D的表达水平显著增加，乙型肝炎肝硬化组患者CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞膜上Sema4D的表达水平显著降低，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）（表2）。2.3 Sema4D在乙型肝炎肝硬化患者不同Child-Pugh分级中的表达 随着Child-Pugh分级的增加，mSema4D+CD4+T淋巴细胞、mSema4D+CD8+T淋巴细胞的表达水平逐渐降低，进一步两两比较，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）（表3）。

2.4 sSema4D在受试者血清中的表达 对照组、CHB组、乙型肝炎肝硬化组sSema4D含量分别为1.54（1.42～1.71）ng/mL、1.08（1.07～1.38）ng/mL、4.87（2.13～14.97）ng/mL，3组间比较差异有统计学意义（H=32.366，P＜0.001）。进一步两两比较，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。

2.5 sSema4D在不同Child-Pugh分级患者血清中的表达 Child-Pugh A级组、B级组、C级组sSema4D含量分别为2.42（0.59～5.65）ng/mL、4.92（2.75～12.73）ng/mL、14.18（4.59～18.43）ng/mL，3组间比较差异有统计学意义（H=11.889，P=0.003）。进一步两两比较，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。

2.6 sSema4D与ALT、HBV DNA的相关性 sSema4D水平与乙型肝炎肝硬化患者的ALT、HBV DNA定量的表达水平均呈明显正相关（r值分别为0.294、0.430，P值均＜0.05）。

3 讨论

Sema4D是一种分子量为150 kD的跨膜蛋白，主要由T淋巴细胞产生，在NK细胞和抗原递呈细胞中也可表达［9］。Sema4D在细胞膜上表达形式为mSema4D，细胞激活后表达升高，随后通过某些蛋白酶的水解，脱落形成血清中的sSema4D［10］。Sema4D的两种表达形式都保留了生物学活性，可以与其受体CD72、Plexin-B（Plexin-B1、Plexin-B2）结合，参与维持B淋巴细胞稳态、T淋巴细胞活化等免疫调节过程［11］。Sema4D在多种疾病中都发挥重要作用，其中在病毒相关性疾病［12］、炎症性疾病［13］及肿瘤性疾病［14］中的研究较多。

HBV的持续感染，使机体长期处于HBV复制状态，肝细胞受损，肝脏发生慢性炎症。长期慢性炎症，肝脏可发生不可逆转的损伤，可使CHB进展至肝纤维化、肝硬化，甚至肝细胞癌［15］。机体的免疫功能紊乱是造成CHB、乙型肝炎肝硬化发生的重要内在原因，其中以T淋巴细胞介导的免疫功能紊乱为主。然而，其具体机制尚未完全阐明。HBV进入机体，激活CD4+T淋巴细胞，其中辅助性T淋巴细胞产生大量细胞因子，参与机体的免疫应答，并促进CD8+T淋巴细胞的成熟、增殖，释放穿孔素、颗粒酶，分泌IFNγ等细胞因子，启动HBV特异性免疫反应，在抑制HBV的复制和传播的同时，对肝细胞也造成了损害［16-17］。多种研究［18-19］表明，HBV促进肝脏炎症进展的过程中，T淋巴细胞逐渐竭耗。本研究结果显示，对照组、CHB组、乙型肝炎肝硬化组患者，CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞的百分比逐渐下降。这一实验结果与楚玉兰等［20］的研究结果相一致，在HBV感染过程中，T淋巴细胞逐渐消耗，机体的细胞免疫功能逐渐降低，肝细胞损伤，最终导致了乙型肝炎肝硬化的发生。

Yang等［21］研究结果表明，在CHB患者中，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞表面mSema4D的表达水平显著高于正常人群，MMP2/9水平的降低导致了CHB患者血清中sSema4D的表达低下，HBV不能清除，外源性注射sSema4D可增强体内CD8+T淋巴细胞的功能。研究［22］显示，血清中sSema4D在CHB患者中的表达水平较低，且与疾病的进展及肝细胞的损伤相关。王桂玲等［23］研究发现，健康者、CHB、乙型肝炎相关原发性肝癌患者，其血清中sSema4D的含量逐步升高，sSema4D可以影响机体内多种免疫细胞的表达，促进炎性因子的产生，从而参与HBV相关性肝病的发生。

Sema4D与HBV感染所致的慢性肝炎关系密切，在CHB进展至乙型肝炎肝硬化的过程中，T淋巴细胞的数量和功能是降低的［24］，而Sema4D是由T淋巴细胞所产生，但其在乙型肝炎肝硬化患者T淋巴细胞膜上的表达情况目前尚无文献报道。本研究结果表明：CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞mSema4D的表达在CHB患者中是最高的，在乙型肝炎肝硬化患者中是最低的，两组患者mSema4D的表达与对照组相比，均有显著性差异（P值均＜0.05）；血清中sSema4D的表达在乙型肝炎肝硬化患者中是最高的，在CHB患者中是最低的，两组与对照组比较，均有显著性差异（P值均＜0.05）。Sema4D在淋巴细胞和血清中的表达在CHB和乙型肝炎肝硬化患者中出现截然相反的结果，分析原因：（1）Sema4D由T淋巴细胞产生，从CHB到乙型肝炎肝硬化的疾病进程中，由于HBV的不断刺激，T淋巴细胞经历了从活化到衰竭的過程。T淋巴细胞活化时，mSema4D高表达，而T淋巴细胞衰竭时，mSema4D产生减少，使mSema4D的表达水平经历了从升高到降低的变化，造成了在CHB时期mSema4D表达增高，sSema4D降低，发展到肝硬化时期mSema4D降低，而sSema4D升高，提示了Sema4D可能作为判断CHB进展的一个重要免疫学指标。有研究［25］发现HIV感染者由于机体T淋巴细胞衰竭，其表面mSema4D的表达也明显降低，这与本研究结果一致。（2）MMP2和MMP9可促使T淋巴细胞膜上mSema4D裂解脱落成为血清中的sSema4D［26］。在乙型肝炎肝硬化患者的疾病进展中，MMP2和MMP9的表达水平升高［26］，介导mSema4D从细胞膜表面脱落，进而导致血清中sSema4D的表达升高。（3）sSema4D除来自于T淋巴细胞膜上mSema4D的脱落外，也可源于其他免疫细胞，如肝星状细胞，而活化的肝星状细胞分泌大量的胶原蛋白是肝硬化形成的重要原因。有文献［27］报道在血吸虫病小鼠体内，发生纤维化的肝组织中肝星状细胞高表达Sema4D及Sema4D受体（Plexin B1和CD72），由此推测，乙型肝炎肝硬化患者血清中的Sema4D也会因肝星状细胞的活化而增高。

Child-Pugh评分是判断乙型肝炎肝硬化患者肝功能及病情严重程度的重要方法，其分级越高代表患者的肝功能越差，病情越严重［28］。本研究进一步分析不同Child-Pugh分级的乙型肝炎肝硬化患者Sema4D的表达水平，结果显示，Sema4D在不同Child-Pugh分级患者中的表达均有所不同，随着Child-Pugh分级的提高，患者mSema4D+CD4+T淋巴细胞、mSema4D+CD8+T淋巴细胞的表达水平逐渐下降，血清中sSema4D的表达水平则呈现逐渐增加的趋势，提示Sema4D的表达水平与乙型肝炎肝硬化的病情严重程度关系密切。此结果与有关文献报道的一致，如过敏性紫癜［29］、多发性骨髓瘤［30］等。

ALT主要存在于肝细胞胞浆中，是反映肝细胞损伤的指标［31］。HBV DNA的含量是判断HBV复制最可靠的指标，高水平的HBV DNA復制可以加重肝细胞的损伤［32-33］。本研究对乙型肝炎肝硬化患者血清中sSema4D与ALT和HBV DNA定量的相关性进行评价，结果显示，sSema4D与患者的ALT、HBV DNA定量的表达均呈现明显正相关。这一结果与已有文献报道相一致，sSema4D可以通过影响患者的临床指标来参与疾病的发生。如何瑜等［34］研究显示，HCV患者NK细胞膜上Sema4D的表达与ALT水平呈正相关，与HCV RNA定量呈负相关，Sema4D参与了疾病进展。HBV的持续感染是造成肝硬化进展的重要因素，高表达的 sSema4D与机体肝细胞的损伤程度及HBV DNA的复制密切相关，本研究结果进一步提示sSema4D参与了乙型肝炎肝硬化患者的疾病进展并与病情严重程度相关。

综上所述，乙型肝炎肝硬化患者T淋巴细胞表达减少，机体发生复杂的免疫调节过程，使得Sema4D在T淋巴细胞膜上的表达降低，而血清中的表达升高，且Sema4D的表达水平随着乙型肝炎肝硬化的疾病严重程度而变化。sSema4D与机体肝细胞的损伤密切相关，可以参与乙型肝炎肝硬化的发生发展。

伦理学声明：本研究于2020年10月18日经由解放军联勤保障部队第九四〇医院伦理委员会审批，批号：2020KYL153，所有受试者均签署知情同意书。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：温雪负责实验设计、标本采集、数据分析及论文撰写；何昱静、袁倩倩、李初谊和卢利霞负责采集标本，分析数据；于晓辉、张久聪负责指导撰写论文并最后定稿。

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收稿日期：

2022-09-07；录用日期：2022-10-09

本文编辑：林姣