CHPF2在胶质瘤中的表达及预后意义

马原浩 赵宗仁 陈中俊 季欢欢 李靖 刘宇 郑金玉

【摘要】 目的 采用生物信息技術分析软骨素聚合因子2（CHPF2）在胶质瘤中的预后意义，并通过实验进一步验证其在正常和胶质瘤细胞中的表达情况。方法 首先在GEPIA和HPA数据库对CHPF2在胶质瘤和正常细胞的表达水平进行分析，随后在癌症基因组图谱（TCGA）和中国脑胶质瘤基因组图谱（CGGA）下载基因表达和临床信息文件对CHPF2在胶质瘤中的表达、预后、功能注释、免疫浸润和免疫检查点等情况作进一步阐明。最后采用蛋白质印迹（Western Blot，WB）技术分析了CHPF2在正常和胶质瘤组织中的表达水平。结果 CHPF2在胶质瘤中的表达量高于正常组织，且随着肿瘤等级的升高而增加。除性别、放疗和肿瘤再发情况外，年龄、化疗、肿瘤复发、IDH、1p/19q及MGMT等在CHPF2高低表达组中均具有统计学差异。CHPF2较一些常见预后标志物（如TP53、MKI67及EGFR等）对胶质瘤患者生存具有更好的预测性能，可以作为一个独立的预后因素，并通过对TCGA和CGGA数据库的独立预后分析结果进行综合的Meta分析作进一步验证。通过GO、KEGG和GSEA方法，对CHPF2可能富集到的通路进行研究。采用TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三种方法，对CHPF2高低风险组中的免疫浸润情况进行分析，并在最后对CHPF2在免疫检查点的情况进行了分析。为了进一步验证可靠性，本研究通过WB技术证实了CHPF2在胶质瘤细胞的表达量较正常细胞中高。结论 CHPF2能够影响胶质瘤的发生、发展和预后，可以作为胶质瘤患者预后的生物标志物。

【关键词】 胶质瘤；CHPF2；生物信息学；免疫；预后

【中图分类号】 R739.41 【文献标志码】 A 【文章编号】 1672-7770（2023）02-0163-10

Abstract： Objective The prognostic significance of chondroitin polymerization factor 2（CHPF2） in glioma was analyzed by bioinformatics technology， and its expression in normal and glioma cells was further verified by experiments. Methods The expression levels of CHPF2 in glioma and normal cells were first analyzed in the GEPIA and HPA databases， followed by downloading gene expression and clinical information files from The Cancer Genome Atlas（TCGA） and The Chinese Glioma Genome Atlas（CGGA） to further elucidate the expression， prognosis， functional annotation， immune infiltration， and immune checkpoints of CHPF2 in glioma. Finally， the expression levels of CHPF2 in normal and glioma tissues were determined using the Western blotting approach. Results CHPF2 expression in gliomas was greater than in normal tissues， and it increased with tumor grade. Except for gender， radiation， and tumor recurrence， the high and low CHPF2 expression groups differed statistically in age， chemotherapy， tumor recurrence， IDH， 1p/19q， and MGMT. CHPF2 outperforms certain popular prognostic markers（e.g. TP53， MKI67， and EGFR） in predicting glioma patient survival and may be utilized as an independent prognostic factor. A complete meta-analysis of the outcomes of separate prognostic analysis of the TCGA and CGGA databases corroborated this further. GO， KEGG， and GSEA techniques were used to examine the pathways for which CHPF2 may be enriched. Initially， three approaches（TIMER， CIBERSORT， and ssGSEA） were utilized to investigate immune infiltration in the high and low-risk groups of CHPF2， and finally， the immunological checkpoints of CHPF2 were examined. To further corroborate the dependability， Western blotting was used to demonstrate the elevated expression of CHPF2 in gliomas relative to normal tissues. Conclusion CHPF2 may be able to influence the occurrence， progression and prognosis of glioma and may serve as a biomarker for the prognosis of glioma patients.

Key words： glioma; CHPF2; bioinformatics; immunology; prognosis

基金项目：淮安市自然科学研究计划项目（HAB202118）

作者单位：223002 淮安，徐州医科大学附属淮安医院

通信作者：郑金玉

胶质瘤是起源于神经上皮的恶性肿瘤，由于胶质瘤的发病机制复杂，导致其具有侵袭性强、易复发、预后差等特点［1-2］，目前尚无有效的胶质瘤治疗策略。虽然一些标志物的发现对胶质瘤的分类和诊断起到了重要作用，但目前的早期诊断和临床治疗效果仍不理想。因此，进一步探索胶质瘤潜在的重要标志物具有重要意义。

硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一种多糖，由 N-乙酰-D-半乳糖胺和D-葡萄糖醛酸残基的重复二糖单元组成，在不同位置用硫酸化残基修饰。CS生物合成和硫酸化平衡受到严格控制，并在疾病的进展中发挥重要作用［3-4］。此外，碳链的特定硫酸化模式决定了其功能和结合亲和力，利用降解铯链的抑制劑或酶的研究表明，铯对肿瘤转移、增殖和黏附过程有相当大的影响［5-6］。软骨素聚合因子（chondroitin polymerization factor，CHPF）是软骨素聚合活性所必需的一种独特的蛋白质因子，对它的鉴定可能会阐明CS的分子基础。本研究经过查询相关文献发现，CHPF在胶质瘤进展中起重要作用［7-9］，同样，CHPF在其他肿瘤中的表达水平也进行了相关研究［10-11］；而CHPF2是否也具有和CHPF一样的作用，目前暂未发现相关性研究报道。

本研究基于生物信息学，分析CHPF2在胶质瘤中的表达、预后及与免疫的关系，为并通过实验作进一步验证，为进一步研究CHPF2在胶质瘤发生发展中的作用机制和治疗等提供依据和参考。

1 资料与方法

1.1 数据下载与处理 从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下载了698例胶质瘤样本及与其匹配的临床信息。从中国脑胶质瘤基因组图谱（Chinese Glioma Genome Atlas，CGGA）数据库（http：//www.cgga.org.cn/）中下载了1 018例胶质瘤样本及相应的临床信息。基因ID的转换使用Perl脚本，数据的处理和矫正采用R软件（版本4.1.2）。临床信息缺失和生存时间为0 d的样本予以删除。

1.2 生存和预后分析 TCGA和CGGA数据库中的临床病理特征在CHPF2高低表达组中的差异性采用R包“ggpubr”分析，本研究中生存曲线、ROC曲线、独立预后及Meta分析均采用R软件进行分析并可视化（涉及的R包中包括“survival、survivalROC、pROC、survcomp、Meta”等）。

1.3 富集分析及共表达分析 基因蛋白间的相互作用关系使用STRING（https：//string-db.org/）网站生成，图形绘制使用“Cytoscape”软件完成，核心基因按照中介中心性进行筛选。 采用R包“clusterProfiler、org.Hs.eg.db、digest、GOplot、enrichplot、ggplot2”进行GO和KEGG富集分析。GSEA富集分析采用GSEA软件完成。基因间的共表达分析使用R包“corrplot”完成。

1.4 免疫 免疫浸润使用TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三种方法联合分析，使用R包“pheatmap”进行可视化。免疫检查点基因与CHPF2的spearman相关性分析采用R包“ggpubr、corrplot”进行可视化。

1.5 主要试剂 CHPF2抗体购买自Sigma公司。ECL试剂盒购买自赛默飞世尔科技有限公司。PAGE凝胶快速准备试剂盒购买自大连美伦生物技术有限公司。RIPA裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5x）和BCA蛋白浓度测定试剂盒购买自碧云天生物技术有限公司。蛋白酶抑制剂购自GLPBIO公司。PVDF膜购买自Millipore公司。鼠抗人β-Actin单克隆抗体、山羊抗鼠IgG购买自Cell Signaling公司。

1.6 Western Blot 正常胶质细胞系（HA1800）和胶质瘤细胞系（C6、T98G和U87）由徐州医科大学神经系统疾病研究所提供。细胞在37 ℃、5%CO2、相对湿度90%的培养箱中进行培养。收集细胞蛋白前使用冰PBS对培养的细胞进行清洗，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，用细胞刮收集细胞至EP管，置于冰上充分裂解30 min。然后将EP管放置于4 ℃离心机中进行离心，收集上清液于新离心管中。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测上清液中的总蛋白并进行配平，加入5xSDS蛋白上样缓冲液混匀，金属浴100 ℃煮沸10 min。将煮沸变性的蛋白样品进入浓缩胶，电泳分离蛋白，然后将蛋白电转到PVDF膜上。3% BSA室温下封闭2 h，加入一抗工作液，4 ℃孵育过夜。TBST清洗条带，加入二抗工作液，室温孵育2 h。继续使用TBST清洗条带，然后将ECL显影液滴加至PVDF膜上，置于凝胶成像系统中曝光显影。使用Image J分析目的条带与各自内参的灰度值比值，判断目的蛋白的表达水平。

1.7 统计学分析 所有统计学分析均采用R（版本 4.1.2）软件完成。所有统计检验均为双侧，以P<0.05认为差异具有统计学意义。其中，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

2 结 果

2.1 CHPF2在胶质瘤中的表达分析 本研究首先在GEPIA数据库中分析了CHPF2在正常与低级别胶质瘤组织、正常与高级别胶质瘤组织中的表达水平。随后，TCGA和CGGA数据库的分析结果显示，随着肿瘤级别的增高，CHPF2的表达水平也随之升高。为了进一步验证上述结果，本研究在HPA数据库中对CHPF2的免疫组化进行分析，结果同样表明，CHPF2随着肿瘤的进展，其表达水平也在逐渐升高，所以CHPF2的表达与肿瘤分级呈正相关。见图1。

2.2 CHPF2的表达与胶质瘤患者的临床病理特征之间的关系 在TCGA和CGGA两个数据库共有的临床特征中，除性别外，CHPF2表达量在临床病理特征的分组中均具有统计学意义；此外，在CGGA数据库中，胶质瘤患者再发情况以及是否放疗与CHPF2表达水平无统计学意义。见图2。

2.3 CHPF2与常见胶质瘤预后标志物对生存的预测在剔除TCGA和CGGA数据库中生存信息缺失的临床样本后，CHPF2低表达组患者的总体生存率高于高风险组，CHPF2表达对于1年、3年、5年胶质瘤患者的生存率均有良好的预测能力（图3）。通过查阅相关文献，本研究选取了胶质瘤患者常见的几个预后标志物，利用ROC曲线和C-index指数比较了它们与CHPF2对胶质瘤患者总体生存率的预测，结果表明，与其他标志物相比，CHPF2仍具有较好的生存预测能力。为了进一步展现CHPF2的预测能力，本研究还比较了各临床预后标志物对胶质瘤患者1年、3年生存率的预测，得到的结果与总体生存的结果一致（图4）。

2.4 独立预后与Meta分析 为了验证CHPF2是否可以作為预测胶质瘤患者预后的独立危险因素，本研究采用Cox回归模型来评估CHPF2的表达与临床特征。首先，通过单因素Cox回归分析来观察CHPF2表达量和每一个临床特征是否与生存相关，随后将单因素中Cox回归分析得到的与生存显著相关的特征提取出来，利用多因素Cox回归同时检测多个特征是否与生存相关。对TCGA和CGGA数据库中共有的临床特征进行分析，无论是单因素还是多因素Cox分析，CHPF2均可以作为胶质瘤患者预后的独立危险因素（图5）。随后，本研究对CGGA数据库中的复发类型以及放化疗与CHPF2表达进行生存分析，分析结果均具有统计学意义。为了进一步证实结果的可靠性，本研究通过Meta分析对TCGA和CGGA数据库分析的结果进行综合分析（图6）。因此，CHPF2可以作为胶质瘤患者预后的独立危险因素。

2.5 富集分析 在确定了CHPF2在胶质瘤中的预后价值后，本研究进行了其在胶质瘤中的生物功能分析。首先，对TCGA和CGGA数据库中CHPF2高低表达组中具有差异性表达的基因取交集，发现TIMP1、MMP9、COL3A1、ANXA1、ANXA2、S100A4、COL1A1和POSTN是其中的核心基因。单因素Cox分析表明，这些核心基因均与胶质瘤患者的预后有关。接下来，对差异性表达的基因进行GO和KEGG富集分析（图7），对GO富集分析的结果进行注释（表1）。最后，本研究还对CHPF2进行了GSEA富集分析，对分析结果进行了可视化（图8），对结果进行了汇总（表2）。

2.6 共表达分析 在TCGA和CGGA数据库中，对CHPF2进行基因间的共表达分析。分别选取呈正/负相关系数（cor）前10的20个基因进行热图的绘制（图9）。与CHPF2呈正相关/负相关的基因以及它们的表达值见表3。

2.7 免疫浸润和免疫检查点 为了进一步分析胶质瘤患者中CHPF2表达与不同免疫细胞和免疫功能之间的关系，本研究使用TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三种方法综合分析免疫细胞和免疫功能在CHPF2高低表达组中的表达水平。本研究以热图的形式对分析结果进行可视化（图10）。近年来，免疫检查点阻断疗法已在多种类型的肿瘤治疗中表现出显著疗效。通过查阅相关文献，本研究选择免疫检查点中关键的一些基因（CD86、PDCD1LG2、CD48、CD40、IDO1、CD200、PDCD1和CD274）进行研究。结果表明，CHPF2与CD200呈负相关，与CD86、PDCD1LG2、CD48、CD40、IDO1、PDCD1和CD274呈正相关（图11）。

2.8 Western Blot 本研究使用神经胶质细胞（HA1800）和人胶质瘤细胞系（C6、T98G和U87）验证了CHPF2在两者中的蛋白表达水平，结果显示，与正常胶质细胞相比，CHPF2的蛋白表达水平在胶质瘤细胞中更高（图12）。

3 讨 论

从组织学来源上说，胶质瘤是源于异常增生的胶质细胞，是神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤。尽管目前普遍采用手术切除、放疗和化疗的联合治疗手段，但由于肿瘤容易复发的特点，严重影响患者的生活质量，总生存率仍然十分不乐观。目前虽然在很多方面取得了很大的技术进步，例如临床影像学、手术治疗和辅助治疗，但胶质瘤患者的临床预后仍然很差。因此，寻找神经胶质瘤的潜在治疗靶点至关重要。随着基因组分析技术的发展，人们发现了更多与胶质瘤预后相关的标志物。这些研究为胶质瘤的治疗带来了新的方向。

基于生物信息学，本研究分析了CHPF2在胶质瘤中的表达和预后意义。本研究发现，CHPF2在胶质瘤中的表达水平明显高于正常组织，并且随着肿瘤等级的升高，其表达量也随之上升。CHPF2的表达与多种临床病理特征有关。通过对胶质瘤患者CHPF2与总生存期（overall survival，OS）的相关性分析，发现胶质瘤患者CHPF2的表达水平越高，OS越低。与其他常见的胶质瘤预后标志物相比，其对胶质瘤患者生存的预测仍具有较高水平。通过Cox回归和Meta分析， 本研究发现CHPF2可以作为一个独立的预后因素。为了进一步研究CHPF2的生物学功能，本研究通过GO、KEGG和GSEA富集分析的方法对其可能存在的潜在通路进行了预测。

本研究还通过共表达分析筛选出与CHPF2关联性最强的一些基因，这些基因与肿瘤的发生发展有着密切关联。如在TCGA数据库中，呈正相关的前5个基因（PDIA4、PLOD3、CD276、KDELR2和TMEM214）与胶质瘤的发生发展关系密切［12-16］，呈负相关的前5个基因（MXI1、ALDH5A1、THRA、RAB5B和IGIP）中，未发现IGIP在胶质瘤中的相关文献报道，但其他基因与胶质瘤关系密切［17-20］。在CGGA数据库，呈正相关的5个基因（CD276、PLOD3、ZYX、FAM20C和CD151）中，PLOD3和CD276在TCGA数据库中同样与CHPF2呈正相关，而ZYX、FAM20C和CD151均在胶质瘤中起着重要作用［21-23］。在呈负相关的基因（CDR1、TUB、RIMS1、NALCN和FAM169A）中，也得到了同样的结果［24-28］。

免疫治疗通过激活人体本身的免疫系统，依靠自身的免疫机能杀灭癌细胞。虽然免疫疗法的成功令人振奋，无数患者在它的干预下取得了显著疗效。但仍有一部分患者对免疫疗法没有反应。通过进一步分析和了解肿瘤免疫微环境将有助于免疫治疗反应性的改善。本研究基于TIMER、CIBERSORT和ssGSEA三种方法，分析了免疫细胞和免疫功能与CHPF2表达间的关系，并且对免疫检查点中的关键基因和CHPF2进行了相关性的分析。本研究最后使用蛋白质印迹法对CHPF2在正常和胶质瘤细胞间表达水平进行分析，实验结果进一步证实了分析结果。

综上所述，本研究通过多维数据分析，揭示了CHPF2表达水平与胶质瘤的发生和预后相关，这可能有助于识别新的生物标志物和靶向治疗策略的发展。

［参 考 文 献］

［1］Wang HX，Xu T，Huang QL，et al.Immunotherapy for malignant glioma：current status and future directions［J］.Trends Pharmacol Sci，2020，41（2）：123-138.

［2］Sharma A，Graber JJ.Overview of prognostic factors in adult gliomas［J］.Ann Palliat Med，2021，10（1）：863-874.

［3］Zhang X，Liu HY，Lin LS，et al.Synthesis of fucosylated chondroitin sulfate nonasaccharide as a novel anticoagulant targeting intrinsic factor Xase complex［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2018，57（39）：12880-12885.

［4］Melgar-Lesmes P，Sánchez-Herrero A，Lozano-Juan F，et al.Chondroitin sulphate attenuates atherosclerosis in ApoE knockout mice involving cellular regulation of the inflammatory response［J］.Thromb Haemost，2018，118（7）：1329-1339.

［5］Rani A，Baruah R，Goyal A.Prebiotic chondroitin sulfate disaccharide isolated from chicken keel bone exhibiting anticancer potential against human colon cancer cells［J］.Nutr Cancer，2019，71（5）：825-839.

［6］Liu XX，Liu Y，Hao JJ，et al.In vivo anti-cancer mechanism of Low-Molecular-Weight Fucosylated Chondroitin Sulfate（LFCS） from sea cucumber Cucumaria frondosa［J］.Molecules，2016，21（5）：625.

［7］Tsidulko AY，Kazanskaya GM，Volkov AM，et al.Chondroitin sulfate content and decorin expression in glioblastoma are associated with proliferative activity of glioma cells and disease prognosis［J］.Cell Tissue Res，2020，379（1）：147-155.

［8］Niu WX，Zhou CX，Cheng CD，et al.Effects of lentivirus-mediated CYP17A1 gene silencing on the biological activity of glioma［J］.Neurosci Lett，2019，692（1）：210-215.

［9］Liao WC，Liao CK，Tseng TJ，et al.Chondroitin sulfate synthase 1 enhances proliferation of glioblastoma by modulating PDGFRA stability［J］.Oncogenesis，2020，9（2）：9.

［10］Fan YH，Xiao B，Lv SG，et al.Lentivirus-mediated knockdown of chondroitin polymerizing factor inhibits glioma cell growth in vitro［J］.Oncol Rep，2017，38（2）：1149-1155.

［11］Hou XM，Zhang T，Da Z，et al.CHPF promotes lung adenocarcinoma proliferation and anti-apoptosis via the MAPK pathway［J］.Pathol Res Pract，2019，215（5）：988-994.

［12］朱傳华，谢琳，刘安民.PDIA4基因沉默对胶质瘤细胞凋亡的影响［J］.岭南现代临床外科，2021，21（2）：177-181.

［13］Zhao YH，Zhang X，Yao JC.Comprehensive analysis of PLOD family members in low-grade gliomas using bioinformatics methods［J］.PLoS One，2021，16（1）：e0246097.

［14］Fu MJ，Zhang JS，Li WF，et al.Gene clusters based on OLIG2 and CD276 could distinguish molecular profiling in glioblastoma［J］.J Transl Med，2021，19（1）：404.

［15］Zhang GF，Wang B，Cheng SQ，et al.KDELR2 knockdown synergizes with temozolomide to induce glioma cell apoptosis through the CHOP and JNK/p38 pathways［J］.Transl Cancer Res，2021，10（7）：3491-3506.

［16］Cheng SY，Chen NF，Wen ZH，et al.Glutathione S-transferase M3 is associated with glycolysis in intrinsic temozolomide-resistant glioblastoma multiforme cells［J］.Int J Mol Sci，2021，22（13）：7080.

［17］Xiao L，Li XD，Mu ZK，et al.FTO inhibition enhances the antitumor effect of temozolomide by targeting MYC-miR-155/23a cluster-MXI1 feedback circuit in glioma［J］.Cancer Res，2020，80（18）：3945-3958.

［18］Dekker LJM，Wu SY，Jurriёns C，et al.Metabolic changes related to the IDH1 mutation in gliomas preserve TCA-cycle activity：an investigation at the protein level［J］.FASEB J，2020，34（3）：3646-3657.

［19］Zhang XK，Ma W，Li JJ，et al.T3 promotes glioma cell senescence and apoptosis via THRA and THRB［J］.J Environ Pathol Toxicol Oncol，2021，40（4）：1-9.

［20］Wang YL，Zhang MD，Zhou FF.Biological functions and clinical applications of exosomal long non-coding RNAs in cancer［J］.J Cell Mol Med，2020，24（20）：11656-11666.

［21］Wen XM，Luo T，Jiang Y，et al.Zyxin（ZYX） promotes invasion and acts as a biomarker for aggressive phenotypes of human glioblastoma multiforme［J］.Lab Invest，2020，100（6）：812-823.

［22］Du SN，Guan S，Zhu C，et al.Secretory pathway kinase FAM20C，a marker for glioma invasion and malignancy，predicts poor prognosis of glioma［J］.Onco Targets Ther，2020，13（11）：11755-11768.

［23］Tilghman J，Schiapparelli P，Lal B，et al.Regulation of glioblastoma tumor-propagating cells by the integrin partner tetraspanin CD151［J］.Neoplasia，2016，18（3）：185-198.

［24］Li XI，Diao HY.Circular RNA circ_0001946 acts as a competing endogenous RNA to inhibit glioblastoma progression by modulating miR-671-5p and CDR1［J］.J Cell Physiol，2019，234（8）：13807-13819.

［25］Zhang LR，Chen DY，Zhang JJ，et al.A novel cholchicine/gadolinium-loading tubulin self-assembly nanocarrier for MR imaging and chemotherapy of glioma［J］.Nanotechnology，2020，31（25）：255601.

［26］Zhang B，Yao JW，Lian XY，et al.Role of RHOC in evaluating an adverse prognosis in patients with glioma and its potential prognostic value［J］.Mol Clin Oncol，2021，15（3）：171.

［27］Liu Y，Chen SM，Peng G，et al.CircRNA NALCN acts as an miR-493-3p sponge to regulate PTEN expression and inhibit glioma progression［J］.Cancer Cell Int，2021，21（1）：307.

［28］He J，Yang J，Shen TL，et al.Overexpression of long non-coding RNA XIST promotes IL-1β-induced degeneration of nucleus pulposus cells through targeting miR-499a-5p［J］.Mol Cell Probes，2021，57（6）：101711.

（收稿2021-12-30 修回2022-05-11）