中草药抑制及杀灭水产病原维氏气单胞菌效果研究

陈安婷，张紫瑞，姜群，张晓君，王春波，高晓建*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.江苏甲客行蟹业有限公司，江苏 扬州 225116）

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）隶属于气单胞菌科（Aeromonadaceae），气单胞菌属（Aeromonas），是一种人-兽-鱼共患的革兰阴性兼性厌氧杆菌[1]。该菌广泛存在于海水、淡水、污水、土壤和动物消化系统等环境中，对环境具有较强的适应性[2]。近年来，维氏气单胞菌对水产动物危害日益严重，并且死亡率高，可感染大口黑鲈（Micropterus salmoides）[3]、斑点叉尾（Ictalurus punctatus）[4]、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）[5]、罗非鱼（Oreochromis niloticus）[6]、异育银鲫（Carassius gibelio）[7]、河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）等鱼类[8]，也可感染罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）[9]、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）[10]、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）[11]、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）等甲壳类[12]，对水产养殖业造成巨大损失，严重制约了水产养殖业的健康发展。

目前，对于水产动物细菌性疾病大多采用抗生素进行治疗，虽然见效快，但其不易降解，会残留在水生动物和环境中，造成环境污染，并且威胁人类健康[12]。此外，滥用抗生素，还会造成多重耐药菌株和耐药基因的产生与传播，给病害防控造成极大困难[13]。以抗生素为主的防控措施，已不符合水产养殖绿色发展的要求，亟需开发绿色、安全、有效的抗生素替代生物制剂。

中草药在预防和治疗动物疾病过程中发挥了重要作用，具有成本低、副作用小、无残留、不易产生耐药性等优点，是抗生素理想的替代品[14]。诸多学者研究发现，中草药对细菌、病毒、寄生虫等病原具有不同程度的抑杀效果[15-18]。文献[19-20]研究发现，中草药含有多糖、有机酸类、生物碱、鞣质等多种活性物质，能够激活动物机体非特异性免疫系统，从而提高其机体免疫力与抗病力。目前中草药在水产动物病害防治方面也有较多报道，在抵抗病原微生物以及增强鱼、虾、蟹等水产动物的免疫功能方面发挥了重要作用[21]。现选取42 种具有广谱抗菌活性的中草药，评价其水浸液对罗氏沼虾病原维氏气单胞菌的抑杀效果，以期筛选出对其抑制作用较好的中草药，为防治维氏气单胞菌引起的水产动物疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从患病罗氏沼虾体内分离出菌株维氏气单胞菌JDM1-1（16S rRNA 登录号：ON365878），由实验室保存。

供试中草药有黄芪（Astragalus membranaceus）、石榴皮（Punica granatum）、黄柏（Phellodendri chinensis cortex）、五倍子（Rhus chinensis）、苦地丁（Corydalis bungeana）、仙鹤草（Agrimonia pilosa）、乌梅（Armeniaca mume Sieb.）、地榆（Sanguisorba officinalis）、鹿含草（Pyrola calliantha）、大黄（Rheum palmatum）、老鹤草（Geranium wilfordii）、佩兰（Eupatorium fortunei Turcz）、萹蓄（Polygonum aviculare）、红藤（Sargentodoxa cuneata）、艾叶（Artemisia argyi）、仙茅（Rhizoma Curculiginis）、紫苏（Perilla frutescens）、番泻叶（Senna alexandrina）、山楂（Crataegus pinnatifida）、玫瑰花（Rosa rugosa）、诃子（Terminalia chebula）、板蓝根（Radix isatidis）、木瓜（Carica papaya）、重楼（Paridis Rhizoma）、党参（Codonopsis pilosula）、金银花（Lonicera japonica）、天南星（Arisaema heterophyllum）、法半夏（Rhizoma Pinelliae）、秦皮（Fraxini cortex）、青蒿（Artemisia caruifolia）、青黛（Indigo naturalis）、野菊花（Chrysanthemum indicum）、海金沙（Lygodium japonicum）、合欢皮（Albiziae Cortex）、小蓟（Cirsium arvense var. integrifolium）、金樱子（Rosa laevigata）、钩藤（Uncaria rhynchophylla）、白头翁（Pulsatilla chinensis）、赤芍（Paeoniae radix rubra）、白芍（Cynanchum otophyllum）、车前子（Plantago asiatica）、女贞子（Ligustrum lucidum）共42 种中草药，购于扬州市同仁堂药房。

1.2 药液的制备

称取上述中草药各50 g，于500 mL 蒸馏水中浸泡30 min 后煎煮，煮沸后转小火煎60 min，用4层纱布过滤并收集滤液；剩余药渣采用上述步骤重复煎煮，收集滤液；将2 次滤液合并浓缩至50 mL，即中草药初始浓度为1 000 g/L；最后将中草药水浸液121 ℃灭菌20 min，于4 ℃冰箱保存备用[22]。

1.3 菌悬液的制备

将供试菌株维氏气单胞菌JDM1-1 接种于LB液体培养基中，28 ℃振荡培养18 h，用无菌生理盐水稀释至1×107cfu/mL，制成菌悬液。

1.4 药物体外抑菌试验

采取琼脂打孔法，测定中草药对维氏气单胞菌JDM1-1 体外抑菌活性。取菌悬液100 μL（1×107cfu/mL），均匀涂布于LB 固体平板上，待菌液晾干后，用直径6 mm 的灭菌打孔器于平板上均匀打3 个孔，每孔加入1 000 g/L 中草药水浸液30 μL，并于4 ℃静置30 min，使中草药向四周扩散，于28 ℃恒温培养24 h，测量抑菌圈直径（d）。判定标准[22]：d<10 mm 为耐药（R）、10≤d<15 mm 为中度敏感（I）、d≥15 mm 为高度敏感（S）。

1.5 测定最小抑菌浓度

根据体外抑菌试验结果，选取抑菌效果较好的中草药，采用二倍稀释法，测定各中草药水浸液对维氏气单胞菌JDM1-1 的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）。无菌条件下将中草药提取液加入LB 液体培养基中，采用2 倍稀释法，使中草药水浸液终浓度分别为500.00，250.00，125.00，62.50，31.25，15.63，7.81 和3.91 g/L，同时设置阳性和阴性对照组；将100 μL 维氏气单胞菌JDM1-1 悬液（1×107cfu/mL）接种至上述不同浓度药液的试管中，28 ℃恒温培养24 h，重复测定3 次。若试管内清澈透明，则表示无细菌生长，其最低药物浓度即为最小抑菌浓度。

1.6 测定最小杀菌浓度

根据最小抑菌浓度测定结果，从清澈透明无浑浊现象的试管中，吸取100 μL 菌液均匀涂布固体平板，于28 ℃的恒温培养箱培养24 h，以琼脂平板上菌落数不超过5 个的最低药物浓度作为该药物对该菌株的最小杀菌浓度（Minimal Bacteriacidal Concentration, MBC）。

2 结果与分析

2.1 42 种中草药提取液的体外抑菌效果

42 种中草药提取液对维氏气单胞菌JDM1-1的体外抑菌效果见表1。由表1 可见，石榴皮、黄柏、五倍子、木瓜、青黛、女贞子6 种中草药抑菌圈直径为10~15 mm，判定为I；地榆、白芍、诃子、赤芍4 种中草药的抑菌圈直径为15~20 mm，判定为S；另外32 种中草药d<10 mm，判定为R。体外抑菌结果表明，防治维氏气单胞菌的首选抗菌中草药为地榆、白芍、诃子、赤芍。

表1 维氏气单胞菌JDM1-1 对42 种中草药的敏感性

2.2 MIC

11 种中草药对维氏气单胞菌JDM1-1 的MIC见表2。地榆、诃子、赤芍的抑菌作用最好，MIC 值为31.25 g/L，白芍、五倍子、石榴皮、乌梅、女贞子、黄柏对维氏气单胞菌JDM1-1 效果次之，木瓜与青黛对维氏气单胞菌JDM1-1 效果一般。

2.3 MBC

11 种中草药对维氏气单胞菌JDM1-1 的MBC见表3。由表3 可见，地榆、诃子、赤芍、黄柏、女贞子的杀菌作用较好，MBC 值均为62.50 g/L；其次为白芍、五倍子、石榴皮、乌梅，MBC 值均为125.00 g/L；木瓜与青黛对维氏气单胞菌JDM1-1 效果一般，MBC 值均为250.00 g/L。

表3 11 种中草药对维氏气单胞菌JDM1-1 的MBC①

3 讨论

3.1 中草药抑菌作用

中草药作为天然药物，种类丰富，含有多种抑制细菌繁殖的活性成分，其抗菌效果方面的研究结果已被国内外学者广泛关注。与抗生素相比，中草药具有无耐药性、毒副作用小、无残留、不易对环境造成污染等优点[23]。目前，中草药在水产动物病害防控方面的应用也越来越广泛。王宝屯等[24]探究了83 种中草药对花鲈（Lateolabrax maculatus）源维氏气单胞菌的抑菌作用，发现乌梅、苏木、五倍子、丁香和艾叶对维氏气单胞菌抑制作用较强；马秀慧等[25]测定了27 种中草药对罗非鱼（Oreochromis niloticus）维氏气单胞菌的抑菌效果，发现五味子对维氏气单胞菌的抑菌效果为高度敏感；张桓桥等[26]采用牛津杯法以及用二倍稀释法，测定了31 种中草药对昆明裂腹鱼（Schizothorax grahami）源维氏气单胞菌的抑菌效果，发现五倍子、地榆、诃子、苏木、黄芩、黄连等6 种中草药抑菌效果最好。本研究探究了42 种中草药对维氏气单胞菌的体外抑菌和杀菌效果，发现诃子、地榆、赤芍三味中草药对罗氏沼虾病原维氏气单胞菌抑制及杀灭作用最强，其MIC和MBC 均为31.25 和62.50 g/L，可作为罗氏沼虾病原维氏气单胞菌防治的理想中草药。

3.2 中草药抑菌成分分析

中草药对细菌的抑制作用与其有效成分有关。中草药含有多种生物碱、苷类、有机酸、黄酮类、鞣质、多聚糖等多种免疫活性物质，由于每种中草药的成分不同，对与之相关的疾病的防治效果也不同[27]。地榆中存在鞣质等生物活性成分，其通过改变细胞膜的通透性，破坏细胞来达到抑菌效果，对革兰阳性菌具有抑制作用[28]。诃子的主要生物活性物质为鞣质及酚酸，是其主要抗菌成分，具有广泛的抗微生物活性，对革兰阳性菌和革兰阴性菌都有高度敏感性，有望用于细菌感染性疾病，特别是耐药菌所致感染的治疗[29]。白芍与赤芍含有的生物活性化学成分相似，主要为单萜及其苷类、三萜类、黄酮类、挥发油类、鞣质类等多种化学成分[30]。本试验发现，对维氏气单胞菌具有明显抑制成效的中草药有地榆、诃子、白芍等。上述研究表明，应根据不同的病原菌选用合适的中草药。

4 结论

本研究探究了42 种常用中草药对维氏气单胞菌JDM1-1的体外抑菌效果，筛选出11 种中草药对维氏气单胞菌JDM1-1 具有较好的抑菌杀菌效果，其中地榆、诃子、赤芍等中草药对罗氏沼虾维氏气单胞菌JDM1-1 的抑菌及杀菌效果最好，其MIC 和MBC 为31.25 和62.50 g/L。在养殖生产中，应根据其MIC 与MBC 值，合理考虑用药剂量及浓度，使得中草药在水产动物体内抑菌以及杀菌效果达到最佳。