微藻育种方法研究进展

周琳琳，郭辰涛，钟晨辉，林 琪*

(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013；2.上海海洋大学，水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；3.海洋生物种业技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361013)

微藻是一类光合效率高、生长速度快的自养型生物，细胞结构为单细胞，通常以二分裂方式增殖，且细胞周期短，具有易培养、适应性强等特点[1-2]。微藻可以利用简单的元素合成具有独特结构和生理功能的生物活性物质，在人类生产与生活中，引起了广泛的关注[3]。作为初级生产者，微藻不仅能将无机环境中的物质能量同化吸收，促进生态系统元素循环，同时还能伴随产生油脂、蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等多种活性物质[4-5]。基于微藻自身的特点，其产业应用广泛分布在生产生活的各个领域中。在农业方面，因含有丰富的营养物质，微藻常作为鱼类、贝类的优质饲料[6]。在生态环境方面，微藻能够利用水中的有机物，包括碳、氮、磷等，并释放溶解氧到水体中，因此其也常被用于废水处理，包括生活废水、工业废水、养殖废水[7]。同样，微藻在生物能源及食品药品等领域也备受关注。由于化石燃料的局限性，微藻作为第三、第四代生物燃料的生产生物已成为当下的一个研究热门，小球藻[8]、微拟球藻[9]在生物柴油制备方面应用较多。在食品药品方面，螺旋藻[10-11]、裂殖壶藻[12]、雨生红球藻[13]等含有的生物活性物质也常被用于开发食品、药品和保健品等。

微藻的育种经历了漫长的发展过程，最早可以追溯到1957年的称重法，这是自然分离选育的一种方法，Moazami N等[14]用此方法筛选得到了2株高油脂含量的微藻。自然分离选育还包括平板划线法、稀释法、微吸管法和 96 孔板法等。但是传统自然选育周期长，同时伴随着选育品质性状不稳定、生物质产量低等缺点，限制了微藻产业发展[15]，因此将一些新兴的技术手段用于微藻种质资源的创新，对微藻产业发展具有深远的意义。本文综述了不同方法在微藻育种领域的研究成果，并分析了其存在的优势和不足，以期为后续的微藻产业发展研究提供参考。

1 微藻育种的应用

微藻虽然含有许多高附加值的产品，如油脂、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)、虾青素等，但原始藻株的生产能力有限，因此提高微藻的油脂含量、生长速度、光合作用效率等性状对于推动微藻产业的发展是十分必要的。随着育种技术应用于微藻，目前已经选育出许多性状优良的突变藻株，并且被广泛应用在生产和生活中。

1.1 水产饲料

微藻含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等营养元素以及各类生物活性物质，可以满足水产动物的营养需求，能有效促进水产动物的生长发育，提高抗逆能力[16]。但微藻生物量、生长速度、环境适应能力等都存在局限性，因此选育出生物量高、生长速度快、环境适应性强的藻株成为了饲料微藻的选育目标之一。已有相关研究报道，如夏金兰等[17]通过紫外线诱变小球藻获得了1株耐高温的突变藻株，这使小球藻最适生长温度提高到了35℃；Ong S C等[18]通过甲基磺酸乙酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)溶液诱变小球藻，使小球藻的生长温度提高到了40℃。

1.2 修复水环境

近年来，随着“绿色水产养殖”理念的提出，日益突出的环境问题也被提上了议程。作为微生物一类，微藻被认为是天然的净化者[19]，自1957年，利用微藻去除水体中的氮、磷等营养盐这一观点被Oswald W J等[20]提出来之后，有研究发现，小球藻对水体中氮和磷的去除率分别可达86%和78%[21-22]，此外，Rugnini L等[23]利用小球藻和链带藻去除水介质中重金属Cu和Ni，在混合金属溶液中的去除率分别达到了95%和90%。

1.3 碳中和

随着工业技术的发展，二氧化碳的排放量逐年增加，对自然环境造成了严重的影响[24]。微藻通过光合作用，可以将大气中CO2转化为有机物，从而实现碳中和。越来越多的科学家发现，藻类的CO2固定率大约为12%，利用藻类捕获和固定环境中的CO2是一种安全有效的方式[25]，因此提高CO2的固定率成为微藻育种的目的之一。Zhu Y等[26]采用60Co-γ射线诱变钝顶螺旋藻获得的突变株对CO2的固定率提高了22.4%；Yang B等[27]通过过表达小球藻的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(Fructose-1，6-bisphosphate aldolase，FBA)，使得细胞固定二氧化碳的效率提高了24.7%。

1.4 生物柴油

生物柴油作为一种清洁能源越来越受到人们的重视。微藻能够在有机物和CO2存在的情况下生产脂质，并且微藻细胞产生的脂质的性质与柴油相似，因此可以将微藻用于生物柴油的制备[28]。但由于微藻细胞个体小，油脂含量低，以小球藻为例，小球藻细胞大小为3～8 μm，油脂含量占细胞干重的20%[29]，相对于人类的生产活动是远远不够的，因此培育出高油脂含量的藻株是微藻育种的主要目标之一。尽管通过藻类制备生物柴油还处于初级阶段，同时生产成本高昂，导致其无法与化石能源竞争，但微藻生物柴油仍然是未来生物能源主要的来源之一[30]。

1.5 活性物质

微藻中含有的生物活性物质也常被添加于食品、保健品、药品等产品中。微藻中含有的不饱和脂肪酸，主要包括EPA和 DHA。其中，EPA可以调节血脂，保护心脑血管，常用作为老年人保健品的重要添加物；DHA除了有保护心脑血管的作用，还是大脑成长，发育的重要物质，常被用于婴幼儿食品[31-32]。螺旋藻含有丰富的蛋白质、多糖、维生素等，具有提高人体免疫力、抗衰老等作用[10]，因此也常被用于保健品。虾青素作为一种抗氧化剂，也用来作为食品、保健品以及生物饲料的重要添加物。雨生红球藻中虾青素的含量为1.5%～10.0%，被称为天然虾青素的“浓缩品”，因此雨生红球藻已成为提取虾青素的主要微藻[33-34]。

2 微藻育种方法

目前，常见的微藻育种方法主要包括2种：诱变育种和新兴的分子育种。诱变育种是指通过物理、化学或者二者相结合的方式处理藻细胞，造成遗传物质发生改变，再通过定向的筛选、培育，来获得目的性状优良的目标藻株[35]。分子育种是指将分子生物学技术应用于育种，主要在分子水平上对基因进行改造，从而改变性状。分子育种能够定向地控制基因表达，它可以实现微藻育种的定点突变，弥补诱变育种的不定向性[16]。

2.1 物理诱变

物理诱变主要用α射线、β射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异，引起分子结构改变，诱发染色体异位、缺失、重组或断裂等，从而引起后代性状产生变异[36]。常用的物理诱变主要包括紫外线(Ultraviolet ray，UV)、射线、重离子束(Linear energy transfer，LET)、常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma，ARTP)、激光、超声波和太空射线[35]。

2.1.1 紫外诱变

紫外诱变是通过UV照射藻类细胞DNA，导致藻细胞DNA双链双螺旋结构变异，碱基错配，从而形成突变体[15]。紫外诱变操作简便易上手，因此其在微藻诱变中被广泛应用。

通过UV照射藻细胞时，功率范围一般为10～30 W、照射距离为10～40 cm、辐射时间选取在30～900 s之间，并且在致死率为80%～95%的范围内选取突变株。目前，通过紫外诱变已经选育出油脂含量高、DHA含量高的微藻[12，37-39]，

具体情况见表1。

表1 紫外诱变在微藻育种中的研究成果Tab.1 Research results of UV mutagenesis in microalgae breeding

2.1.2 射线诱变

射线包括X射线、γ射线、α射线、β射线等，是一种能量高、穿透力强的电离辐射源。射线诱变是指辐射造成DNA分子共价键断裂或者分子缺失，当修复出错时造成突变，进而获得突变体[40]。γ射线相对于其他射线具有更强的穿透力，可诱变藻株产生多种活性代谢物，如酶和维生素等[41-42]。目前在微藻的育种中多使用60Co-γ诱变原始藻株，射线的诱变剂量一般为100～1 600 Gy，获得的突变株的油脂含量有较大幅度的提高[43-45]，具体见表2。

表2 60Co-γ射线诱变选育高油脂藻株研究成果Tab.2 Results of 60Co-γ ray mutagenesis and breeding of high lipid algae

2.1.3 重离子束诱变

离子辐射源包括质子、氦和带正电的重离子等，长期以来被用作微生物和植物育种的诱变剂[46]。其中使用较多的是重离子，而LET是指被剥掉或部分剥掉外围电子后的带正电的原子核通过大型加速器装置加速而形成的具有能量的射线。相较于传统的诱变源，LET具有传能线密度大、相对生物学效应高、损伤后修复效应小、能量沉积的空间分辨性好等生物学优势[47]。目前，诱变实验中使用较多的LET主要是碳离子束，使用的碳离子的能量为80 MeV/μ，密度为31 keV/μm，诱变剂量通常在10～160 Gy之间，并且获得了性状优良的藻株[9，48-50]，具体见表3。

表3 重离子束诱变育种的研究成果Tab.3 Research results of heavy ion beam mutagenesis breeding

2.1.4 常压室温等离子体诱变

ARTP 诱变是通过释放活性粒子，作用于微生物的细胞壁或细胞膜，使其结构和通透性发生变化，引起基因损伤，致使突变，从而获得性状优良的藻株。相较于其他诱变方法，ARTP诱变具有高效、稳定、无毒、环保、成本低等优点[51]。

采用ARTP诱变时，一般是在功率为80～120 W、通气量为10 ～12 SLM、距离为2～5 mm的条件下进行的，诱变时间选取在10～150 s之间。利用ARTP选育出的突变株性状优良，表现在油脂含量高、虾青素含量高等[52-55]，具体见表4。

表4 ARTP在微藻育种中的研究成果Tab.4 Research results of ARTP in microalgae breeding

2.2 化学诱变

化学诱变是指使用一些导致基因突变的化学诱变剂，使遗传物质发生突变，从而获得性状优良的突变株。在生物育种中，化学诱变对于获得优良性状的诱变体是一个高效且简单的方法，这是因为化学诱变能够在DNA非致死点反复诱变，由此可产生稳定的遗传物质[56-57]。目前常用的化学诱变剂主要是烷化剂，包括EMS、亚硝基胍(Nitrosoguanidine，NTG)、硫酸二乙酯(Diethylsulfate，DES)等。化学诱变对基因的损害较小，具有特异性，并且具有操作简单、成本低、突变范围广等优点，在诱变育种中被广泛使用。近年来，化学诱变在寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、雨生红球藻(Haematococcupluvialis)、栅藻(Desmodesmussp.)等均获得突变株[56-59]。

使用化学诱变剂诱变微藻时，采用较多的方法是在固定的时间内，采用不同浓度的诱变剂[58-61]进行实验，这有利于缩短实验时长。如NTG诱变微藻，NTG的浓度范围一般在1～5 g/mL之间，诱变时间通常设定为10～60 min。具体见表5。

表5 不同化学试剂诱变微藻研究成果Tab.5 Research results of mutagenesis of microalgae by different chemical reagents

2.3 分子育种

分子育种，是一种新兴的手段，包括基因工程育种和基因编辑育种。基因工程育种，也被称为转基因育种，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使之能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，以改变生物原有的遗传特性获得新品种。当前，外源基因导入细胞内的技术主要包括电转法、微粒轰击法(基因枪法)、农杆菌介导转化法、玻璃珠搅拌法、自然转化法、细菌接合法和脂质体转化法[62]。近年来，Crispr/cas9等基因编辑育种技术也逐渐被应用于微藻[63]，与基因工程育种不同的是，基因编辑是对特定基因进行修饰，没有外源基因的导入。这2种新兴的育种方式具有针对性强、稳定性强的特点，能够通过定向改造遗传物质获得较理想的突变藻株[15]。

相对于传统的育种技术，新兴的微藻育种还处于初级阶段。三角褐指藻作为模式生物，无论是基因工程，还是基因编辑技术，都有广泛的应用，在微藻育种中的主要目标产物为脂质、甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)等[63-67]，具体见表6。

表6 分子育种在微藻育种中的研究成果Tab.6 Research results of molecular breeding in microalgae breeding

3 微藻育种存在的问题及解决方法

虽然微藻育种技术已经发展多年，但微藻育种仍然处于一个发展阶段，并存在以下几个问题：1)产量和品质互相矛盾。在藻类育种的过程中，筛选得到生产率高、性状优良的品种是最理想的结果。但实际情况中，产量和品质却很少能同时提高，研究发现这可能是控制品质和产量的基因是相互连锁的，提高一种性状的基因表达会影响其他基因的表达，很难一起提高，甚至产生抑制作用，这是因为微藻是单细胞生物，其繁殖体系使基因间的连锁难以打破[68]。2)诱变因子及诱变剂量难以精确控制。不同种类微藻诱变因子和诱变剂量是不同的，因此在育种时如何选择诱变因子及诱变剂量是目前诱变育种的一大难题。研究发现，同一种类的微藻，不同的诱变因子均能筛选出性状优良的藻株。尤其是化学试剂的诱变剂量更加难以确定，化学诱变剂处理强度的衡量通常用暴露剂量，而不是吸收剂量，因为吸收剂量一般情况下无法确定，但对遗传物质产生作用的却是吸收剂量，因此化学诱变中化学物质的诱变剂量通常是一个估计值[69]。3)筛选难度大。诱变后的藻株样本容量较大，但并非所有的诱变株都是符合诱变目的的藻株，因此需要对诱变后的藻株进行筛选，以获得所需的藻株。另外，筛选出的藻株还需要连续培养几代，确保遗传物质能够稳定遗传。筛选出性状优良的藻株是一个费时费力的过程。

针对微藻育种技术存在的问题，可以从以下两个方面解决：一方面，研究人员需要熟悉不同藻种的生理特性，选择最适合的育种方法，或者还可以通过物理诱变和化学诱变相结合即复合诱变方法，从而选育出最佳的藻株；另一方面，微藻诱变育种与当前先进的基因工程相结合，如可以通过基因组重测序技术、转录组测序、蛋白质组分析等技术，从DNA、蛋白水平上揭示表型与基因型之间的联系，掌握诱变作用机理，从而实现高效、定向诱变育种。

4 展望

不同的诱变方法有各自的优劣势。物理诱变方法操作简单、易上手，也是目前使用最为广泛的方法，但其设备要求高，前期投入成本较大；化学诱变方法弥补了物理诱变投入成本过高的不足，但化学试剂可能具有毒性，这加大了实验操作的风险；基因工程育种相对前两种方法，克服了诱变方向的随机性，实现了定点诱变，但我国目前与基因工程育种相关的实验做得相对较少，技术相对不成熟，并且基因工程目前还存在争议，因此还需要进一步研究。

尽管我国微藻诱变育种仍处于初级阶段，但近年来研究者们利用诱变方法仍然培育出了许多含油量高、生长速率快、生物量高的藻株，这为未来优化选育技术和提高藻株性状奠定了坚实的基础。此外，可将微藻育种与实际生产结合起来，根据实际需求动态地调整目标，促进微藻的可持续发展。通过诱变方法选育性状优良的藻株，提高微藻自身含有的天然高附加值产物含量，推动微藻育种的高效发展，为微藻产业链带来巨大的经济效益和社会效益。