麻疹减毒活疫苗生产工艺优化

孙雅 刘思墨 石婷婷 商雪萌 唐浩博 简哲 邱梅 王刚

[关键词]麻疹疫苗；工艺优化；细胞工厂；感染复数；换液次数

麻疹是一种多发于儿童的急性呼吸系统传染病，也是一种疫苗可预防疾病[1]。在没有麻疹疫苗的年代，麻疹发病数曾超过957万例/年，我国于1965年开始，通过全国大规模接种麻疹疫苗（包括其联合疫苗），使其发病数降低至2020年的856例/年，證实了接种该疫苗是预防麻疹最有效的措施之一[2]。但在麻腮风联合减毒活疫苗（measles，mumpsandrubellacombinedvaccine，live，MMR）生产工艺中，麻疹病毒易与其他病毒成分发生免疫干扰，易出现病毒滴度下降幅度过大、滴度波动幅度不稳定等问题，进而影响该疫苗的产能及品质[3]。

本研究在麻疹疫苗原液现行生产工艺的基础上，对其培养容器、感染复数（multiplicityofinfection，MOI）和换液次数进行调整优化，为提高麻疹疫苗及其联合疫苗的病毒滴度、有效性、持久性提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与毒种细胞

细胞与毒种细胞为原代鸡胚细胞，来自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；毒种为麻疹毒种沪-191株，来自上海生物制品研究所，原代鸡胚细胞及工作代毒种批由本室按照《中华人民共和国药典》（2020版）[4]制备。

1.2 主要试剂及仪器

新生牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；水解乳蛋白、MEM购自美国Gibco公司；M199培养基购自美国Sigma公司；胰酶购自美国BD公司；培养容器为Nunc40层细胞工厂（40-layercellfactory，CF40）和10层细胞工厂（10-layerCellfactory，CF10），购自美国ThermoFisher公司；细胞工厂显微观测系统为XBG-Ⅱ，购自北京一恒公司；全自动细胞计数仪为CellometerAutoT4，购自美国Nexcelom公司。

1.3 细胞计数与观察

使用全自动细胞计数仪测定细胞悬液中的总细胞数和活细胞数；使用细胞工厂显微观测系统观察种毒后的病变程度。

1.4 优化方案设计与分组

疫苗原液根据《中华人民共和国药典》（2020版）[4]制备，细胞制备选用9～11日龄来自SPF鸡群的鸡胚蛋，蛋壳经消毒后，取出鸡胚，去除鸡胚头部及内脏，剪成碎块。用0.125%的胰蛋白酶溶液37±1℃水浴消化18～22min，以0.2%水解乳蛋白Earle’s液分散细胞后，将细胞悬液加入终浓度为2～3%灭能新生牛血清的无抗生素细胞培养液中，使细胞浓度在4～7×105/ml，每批所制备的细胞总量至少满足4个CF40或16个CF10使用，同时取样用于细胞计数，种毒采用细胞培养混合病毒接种方式制备，即在细胞培养液中按照MOI加入种毒液，移送33±1℃洁净培育室静置培养，随后按规定和试验分组进行换液，根据病变程度进行洗换、收获，按规定进行原液合并。对照组取2020年本室生产的麻疹疫苗商业批（Me202010，Me202011，Me202012），原生产工艺为CF40，MOI为0.015，静置培养3d后更换1次生长液；试验组分为A、B、C、D、E、F共6组，使用CF10作为培养容器培养原代鸡胚细胞，制备麻疹单次病毒收获液，即原CF40生产工艺等比例缩小4倍，随后分别按照MOI为0.008、0.015、0.03进行病毒接种，静置培养2d后和4d后更换二次生长液。具体分组情况见表1。

1.5 MMR中病毒滴度检测及热稳定性试验

病毒滴度检测根据《中华人民共和国药典》（2020版）[4]规定的方法进行，将试验组的麻疹病毒滴度热稳试验结果，与商业批麻腮风成品中麻疹病毒滴度热稳试验结果进行比较。

1.6 效果评估

通过比较活细胞数、细胞存活率来确认各组间基线一致性，通过比较麻疹病毒滴度与细胞病变程度、麻腮风成品中麻疹病毒滴度及其热稳后滴度来评估优化后的工艺效果。

2 结果

2.1 细胞计数结果

本研究使用全自动细胞计数仪，计数较为客观准确，使用的原代鸡胚细胞为纯手工制备，必然存在一定的各组间差异，各组细胞悬液所含活细胞数均在1.35×106～1.48×106cells/ml，存活率均在75.9%～90.9%，以上数据均符合《中华人民共和国药典》（2020版）[4]对原代鸡胚细胞的相关要求，均可配制为4～7×105/ml的细胞培养液，说明试验组与对照组具有较好的基线一致性，见表2。

2.2 麻疹病毒滴度与细胞病变程度结果

麻疹病毒二收滴度高于一收滴度，原液合并后滴度折中，试验各组滴度部分提高、部分降低，其中E组方案滴度均数和标准差波动幅度较理想，一收滴度为（5.77±0.07）lgCCID50/ml，二收滴度为（6.00±0.08）lgCCID50/ml，原液滴度为（5.97±0.05）lgCCID50/ml，见表3，说明E组试验方案较优化前工艺制备的疫苗单收液、原液的质量更高、稳定性更好。使用细胞工厂显微观测系统观察对照组与E组在两次收获前的病变图，发现E组病变程度更高、面积更大、分布更均匀，与滴度结果相匹配，见图1。

2.3 MMR中麻疹成分滴度及热稳试验结果

麻疹病毒自身耐热性较差，热稳试验后各组滴度均有不同程度下降，其中E组方案制备的MMR中麻疹单基滴度及热稳后滴度较理想，单基滴度为（4.23±0.07）lgCCID50/ml，热稳后滴度为（4.10±0.04）lgCCID50/ml，均数下降0.13lgCCID50/ml，见表4。

3 讨论

近年来，细胞工厂系统凭借其生产效率高而成本低、洁净级别高而污染风险低和储运便利等诸多优点，非常有利于细胞生长与病毒培养，因此受到越来越多的疫苗生产企业选择[5]，其中CF40具有25280cm2的超大培养面积常作为首选，但在实际应用中相对于CF10，其存在如顶层与底层的细胞生长及种毒效果差异较大、中间层平面较难观察、重量与体积较大、进/排液时间较长、价格较昂贵等问题，且这些问题无法规避，常造成生产过程中的诸多不便与制品的批内、批间一致性不稳定[6]。本研究通过比较两种不同培养容器所制备的疫苗在不同阶段的各项指标，发现CF10所制备的疫苗可能被其他变量所影响，在单收液及原液阶段滴度各有升降，但热稳后滴度均有明显提高，表明CF10可能更适合于制备麻疹疫苗，尽管其产能明显降低，但随着我国出生人口数不断下降[7]、部分儿童家长选择同款进口疫苗等原因[8]，麻疹系列疫苗的国内市场份额在不断缩小，产能也应随市场份额调整[9]，加之近年来疫苗不良事件频发，人们对疫苗的安全性和有效性更加重视[10]，作为疫苗生产厂家应不断进行工艺优化以生产出品质更优的疫苗，目前须往更少更精的方向优化疫苗生产工艺，并不断对标国际先进工艺，争取通过世界卫生组织认证，不断开拓海外市场[11]。

MOI是感染时病毒与细胞数量的比值，是控制病毒感染的重要工艺参数，MOI过低可能导致病毒无法短时间内感染全部细胞，病变过轻过慢；MOI过高可能导致病变过快、过重使细胞过早凋亡而无法继续复制病毒。且原代鸡胚细胞为纯手工制备，批内、批间易存在较大的差异，因此MOI必须控制在较为狭窄的范围内，否则可能会对单收液和原液滴度产生较大不良影响[12]，本研究通过比较三种不同MOI发现，当MOI为0.015时，所制备的麻疹疫苗原液质量较高。

麻疹疫苗原液采用细胞培养混合病毒接种的方式制备[13]，生长液随着细胞的生长增殖，营养成分逐渐被消耗、代谢产物逐渐增多[14]，会一定程度上影响细胞的形态结构、功能、发展及病毒的感染复制，进而影响制品的品质[15]。因此，本研究通过增加换液次数，尽可能减少低养分、高代谢物培养环境对细胞和病毒的不良影响，以期生产出更高品质的疫苗。

4 局限性与展望

本研究受成本、人员等因素限制，存在如缺少各组间单因素比较、缺少统计学分析、缺乏对病变程度的客观参照或量化比较等局限性。

本研究发现E组工艺各方面指标优于以往，且CF10具有小巧、轻便和便宜等优点，有望在一定程度上节省物料、时间和人工成本，因此本研究对于疫苗生产实践有一定实用价值，对后续开展相关的试验研究和进一步工艺优化有一定理论参考意义。

5 结论

本研究通过在原有麻疹减毒活疫苗原液的制备工艺基础上的调整优化发现，使用CF10、MOI为0.015和两次换液能够进一步提高疫苗品质。