大明胶囊治疗高脂血症的网络药理学分析及分子对接验证研究

张越 张卉青 杨提 徐春梅

[关键词]大明胶囊；高脂血症；网络药理学；靶点预测；分子对接

高脂血症是由于脂肪代谢或转运异常而导致的血浆中脂质结构紊乱[1]。高脂血症是心血管疾病发病和病死的主要危险因素。他汀类是血脂异常的首选治疗药物，尽管他汀类药物治疗对心血管事件有积极作用，但患者的依从性往往较差[2]。因此，探索不良反应较低且作用有效的降脂药物具有重要意义。

中药治疗高脂血症具有疗效确切、毒性相对较低、成本低等优点，因此得到越来越多人的关注。大明胶囊是经国家食品药品监督管理局批准的具有活血化瘀作用的中成药。大明胶囊由6味中药，即大黄、决明子、丹参、陈皮、人参和茯苓组成，对高脂血症患者有确切疗效[3-4]。但由于大明胶囊所含成分复杂，其治疗高脂血症的关键活性成分及潜在分子机制至今尚不明确。本研究通过网络药理学研究方法，分析大明胶囊治疗高脂血症的分子机制，为后续研究提供理论基础。

1 方法

1.1 大明胶囊相关靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获得中成药大明胶囊成分的化学组分，根据口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的2个ADME属性值进行初步筛选以获得活性成分及各活性成分的蛋白質靶点，并根据已发表的文献报道补充未检索到的活性成分的已知靶点。最后使用UniProt蛋白质数据库对活性成分的蛋白质靶点名称进行统一规范。

1.2 高脂血症相关靶点的筛选

以“hyperlipemia”为关键词，利用GeneCards、DisGeNET数据库获取高脂血症的潜在治疗靶点，并以DrugBank数据库中临床一线治疗药物的靶点为补充。合并3个数据库得到的靶点后，删除重复值得到高脂血症的潜在治疗靶点。

1.3 大明胶囊成分-高脂血症共有靶点蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络构建

利用Venny2.1对大明胶囊成分相关靶点与高脂血症靶点取交集并绘制韦恩图。通过STRING数据库构建交集靶点蛋白相互作用网络模型，将生物类型设定为“homosapiens”，最小互作阈值设定为“highestconfidence>0.9”，其余选项设为默认值，得到大明胶囊成分-高脂血症靶点PPI网络。

1.4 基因本体（geneontology，GO）与京都基因与基因组百科全书（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）富集分析

GO对基因和蛋白质功能进行限定和描述，将基因功能分为三个部分：细胞组分（cellularcomponent，CC）、分子功能（molecularfunction，MF）、生物过程（biologicalprocess，BP）[5]。KEGG是一个整合基因组、化学和系统功能信息的数据库[6]。应用R语言软件中ClusterProfilerGO.R插件及Perl语言对大明胶囊活性成分及药物-疾病共有靶点进行GO和KEGG通路富集，对结果进行可视化分析，得到大明胶囊治疗高脂血症的生物功能和信号通路。

1.5 大明胶囊成分-高脂血症靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape3.7.2构建大明胶囊成分-高脂血症靶点-通路网络图，利用Cytoscape3.7.2内置工具包分析成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度、介度及紧密度等，并根据网络拓扑学参数筛选核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.6 分子对接验证

利用软件AutoDockVina对确定的大明胶囊活性成分和核心靶点进行分子对接验证，研究其结合方式和结合程度。

2 结果

2.1 大明胶囊活性成分靶点的获取

通过TCMSP数据库初步获取、ADME筛选得到陈皮、大黄、丹参、茯苓、决明子、人参的活性成分分别为5、10、19、6、13、17种。活性成分的作用靶点分别为69、70、103、22、67、115个，合并删除重复值后共得到靶点196个。

2.2 高脂血症相关靶点的获取

通过GeneCards数据库共得到高脂血症潜在靶点1463个。根据经验设定Score≥2倍中位数的目标靶点为高脂血症的潜在靶点，通过GeneCards所得高脂血症靶点Score最大值为45.99，最小值为0.12，中位数为0.50，故设定Score≥1的靶点为高脂血症的潜在靶点。结合DisGeNET、DrugBank数据库补充，合并删除重复值后，得到541个高脂血症相关靶点。

2.3 大明胶囊活性成分-高脂血症靶点PPI网络构建

将筛选的大明胶囊活性成分与高脂血症靶点取交集绘制韦恩图，得到64个共有靶点，见图1。在STRING平台中录入共有靶点得到大明胶囊活性成分靶点-高脂血症靶点PPI网络，见图2。

2.4 靶点功能与通路的富集分析

应用R语言软件ClusterProfilerGO.R插件对大明胶囊治疗高脂血症的潜在作用靶点进行GO和KEGG分析，并对结果进行可视化。

生物过程分析显示，这些靶点主要富集于类固醇代谢过程、营养水平的应答等，见图3A。分子功能分析显示，其靶点主要涉及受体配体活性、信号受体激活因子活性等，见图3B。细胞组分分析表明，这些靶点主要涉及膜筏、膜微区、膜区等，见图3C。

KEGG通路分析提示，大明胶囊治疗高脂血症的机制可能与脂质和动脉粥样硬化信号通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路等有关，见图3D。

2.5 大明胶囊成分-高脂血症靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape3.7.2软件构建大明胶囊成分-高脂血症靶点-通路网络，见图4。再通过软件内置的NetworkAnalyzer工具分析大明胶囊调血脂网络拓扑学参数，得到核心成分及核心靶点。Cytoscape网络分析结果表明山柰酚（kaempferol）连接度、介度、紧密度最高，分别为21、0.15、0.45，预测山柰酚为大明胶囊治疗高脂血症的主要成分。HSP90AA1在靶点网络中的连接度、介度、紧密度最高，分别为35、0.25、0.48，预测其为大明胶囊治疗高脂血症的最重要靶点。NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1亦为相对重要靶点。

2.6 分子对接验证

上述结果表明，大明胶囊治疗高脂血症的核心靶点为HSP90AA1、NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1，主要成分为山柰酚。利用AutoDockVina软件将山柰酚与核心靶点相互作用进行分子对接预测。AutoDockVina软件对预测模型进行打分，即Affinity（kcal/mol），其值越小越易与蛋白质结合。预测结果显示，山柰酚与HSP90AA1、NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1的结合能分别为-5.8、-3.95、-5.64、-5.76、-5.04、-5.59、-4.07、-5.7、-4.91、-5.29、-6.67、-4.68kcal/mol，均在-3.95～-6.67kcal/mol，說明山柰酚与核心靶点均具有较强的结合能力。其中山柰酚与IL-1β的结合能为-6.67kcal/mol，表明其结合能力最强，见图5。

3 讨论

大明胶囊具有清热降浊、活血化瘀之功效，适用于热郁血瘀型高脂血症的辅助治疗。既往研究表明，蒽醌类化合物芦荟大黄素作为大明胶囊的潜在有效成分之一，具有调节血脂、降低胆固醇的作用[7]。网络药理学是建立在系统生物学理论基础上的一门新的学科，它分析生物系统的网络，选择特定的信号节点来设计多靶点药物分子[8]。本研究通过网络药理学研究方法从整体角度探索大明胶囊治疗高脂血症的活性成分及其分子作用机制，结果预测黄酮类化合物山柰酚可能为大明胶囊治疗高脂血症的主要成分。山柰酚是各种植物性食品中主要的膳食类黄酮，具有抗癌、抗氧化和抗动脉粥样硬化等多种有益特性[9]。山柰酚可通过抑制Akt和激活PPARα、PPARδ发挥降低三酰甘油的作用[10]，还可通过TLR4/NF-κB信号通路的失活上调miR-26a-5p缓解ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡[11]。上述研究表明山柰酚具有调节血脂、改善动脉粥样硬化的作用。

3.1 大明胶囊治疗高脂血症关键靶点分析

根据上述研究结果，大明胶囊治疗高脂血症的关键靶点为HSP90AA1、NCOA2、AKT1、ADRB2、RXRA、TNF、NCOA1、PPARG、MAPK1、IL-6、IL-1β、ESR1。根据分子对接结果，IL-1β与山柰酚的结合能力最强，可能是大明胶囊治疗高脂血症的关键靶点。炎症反应伴随着高脂血症的发生发展，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子均与高脂血症有着密切的联系[12]。IL-1β是炎症反应的关键介质，其对宿主反应和抵抗病原体至关重要，且能够加剧急性和慢性疾病的组织损伤[13]。在一项小鼠实验中，ApoE和IL-1β双敲除小鼠主动脉窦动脉粥样硬化病变的大小和硬化面积比明显小于单敲除ApoE小鼠[14]。IL-1β通过抑制炎症因子的表达，调节动脉粥样硬化的炎症反应，可减少脂质过氧化物的产生，进而改善血管内皮细胞功能[15]。

3.2 通路与生物进程分析

GO-CC富集结果表明，大明胶囊主要在细胞膜上发挥其降血脂作用，且主要分布于膜阀、膜微结构域。膜阀及膜微结构域是高度动态且富含甾醇和鞘磷脂的结构域[16-17]，在信号传导、响应外部刺激等方面起着至关重要的作用[18]。GO-MF结果表明，大明胶囊的降血脂作用主要与细胞内受体配体活动及信号受体激活因子等有关。大明胶囊能够通过激活AMPK通路使血清和肝脏中的脂质减少。AMPK的激活可增强PPARα的表达和脂蛋白脂肪酶的转录，导致三酰甘油水解；也可增强低密度脂蛋白受体蛋白表达促进脂质代谢[19]。大明胶囊还可通过SIRT1/AMPK信号通路增加心肌细胞自噬，抑制氧化应激和炎症反应，从而改善心肌梗死后的心功能[4]。KEGG结果表明，大明胶囊降血脂作用涉及的主要信号通路包括脂质和动脉粥样硬化信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等，亦证明大明胶囊通过作用于多个信号通路共同发挥其治疗高脂血症的作用，其主要与IL-6、PPARG、TNF、NOS3、VCAM1、AKT、MAPK1等炎症、氧化应激相关信号因子有关。

本研究通过网络药理学研究方法，筛选了大明胶囊治疗高脂血症的主要化学成分及核心靶点，发现了山柰酚在大明胶囊降血脂中发挥重要的作用，并推测其治疗高脂血症的药理学机制可能是通过调控炎症反应及氧化应激因子实现的，为今后大明胶囊治疗高脂血症的深入研究提供了理论基础。