肺炎克雷伯菌乳房炎的致病机理及其耐药性分析

李海源

莘县畜牧兽医事业发展中心，山东聊城 252400

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛在养殖过程中乳腺部位受到外部物理、化学或病原微生物的入侵而导致炎症反应的一种常见疾病。患病乳房内部会发生病理变化，主要表现为乳汁中体细胞数量增多、pH值大于7.0，NaCl的含量增高，电导率上升，细菌学鉴定为阳性等[1]。

奶牛乳房炎是一种危害牛群范围广的疾病，国外发病率可达25%～60%，国内的平均发病率可达33.4%[2]。我国每年由于乳房炎而淘汰的奶牛占总淘汰奶牛数的10%，经济损失高达6 亿元人民币[3]。

奶牛乳房炎致病微生物主要分为传染性病原微生物和环境型病原微生物，其中环境型病原微生物占主要地位[4]，主要包括大肠杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌、沙雷氏菌、肠球菌和肺炎克雷伯菌等。它们广泛存在于垫料等牛舍环境中，感染细菌后，可引起乳房部位发生急性红肿，坚硬且有触痛，乳汁呈絮状或水样，严重者产奶量显著下降[5]。其中的肺炎克雷伯菌还能进一步感染奶牛尿道、呼吸道、甚至血液等，引发尿道炎、肺炎、菌血病[6]。

目前对肺炎克雷伯菌通常采用β-内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类等抗生素药物治疗，但由于这类药物的滥用，导致肺炎克雷伯菌合成超广谱β-内酰胺酶、碳青霉烯酶和氨基糖苷钝化酶的基因表达上调，耐药性进一步增强[7]。因此，对肺炎克雷伯菌的生物学特性、毒力基因和耐药性有更深刻的认识是非常必要的。

1 生物学特性

肺炎克雷伯菌主要存在于机体口腔、皮肤和肠道以及自然界的水、土壤等外界环境中。该菌为革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科，克雷伯菌属，通常分为5 个种和3 个亚种，分别为肺炎种、产酸种、土生种、植生种、变形种，肺炎亚种、臭鼻亚种和鼻硬结亚种[8]。

肺炎克雷伯菌为兼性厌氧菌，能通过氧化和发酵等方式进行代谢，具有荚膜和菌毛等主要抗原成分，还能够产生多种致病毒力因子。此菌对营养要求不高，在普通培养基中即可生长繁殖，菌落呈现白色粘液状，体型偏大，用接菌环挑起后容易拉丝[9]。在37 ℃、pH值7.0～7.6条件下生长迅速，能产生大量荚膜多糖、脂多糖等细胞外毒性复合物，形成较厚荚膜[10]。

当机体免疫力正常时，肺炎克雷伯菌只是潜伏在机体内，而不会引发疾病；当机体免疫力下降时，其可突破机体免疫屏障，迅速繁殖并产生毒性，导致奶牛出现明显炎症反应，进而发生脑膜炎、腹膜炎、乳房炎、肺炎、胆囊炎、尿路感染和败血症等，发病率和致死率较高[11]。尤其在乳房炎方面，肺炎克雷伯菌会破坏乳腺分泌乳汁的能力，且发病缓慢，在早期不易发现，导致奶牛的泌乳能力长时间下降[12]，且治疗后最高只能达到50%治愈率，比其他同种大肠菌群感染的治愈率更低[13]。

肺炎克雷伯菌基因组有5 000～6 000 个基因，其中约有2 000 个核心基因，剩下的均为副基因。在肺炎克雷伯菌毒力因子的合成中，核心基因和副基因共同进行编码，如荚膜多糖、脂多糖、黏附因子和铁载体等物质[14]。

2 流行病学调查

肺炎克雷伯菌感染范围广。有研究者对津巴布韦多个患病奶牛的致病菌数据进行分析，发现肺炎克雷伯菌占细菌总数的15.5%[13]。曹菲菲[15]等在2017—2018年，对浙江、江苏、广东、安徽、河北和内蒙古等地区11 个奶牛场的乳房炎奶牛的牛奶样本进行采样，从856 份样品中分离出119 株肺炎克雷伯菌。Gao[16]等于2014—2016年对我国黑龙江、辽宁、北京、山东、天津、河南等地大型奶牛场的乳房炎奶牛的牛奶样品进行分析，发现肺炎克雷伯属细菌的分离率达13.0%。

肺炎克雷伯菌能长时间稳定存在，是影响奶牛乳房炎发病率的重要因素。Song[17]等于2018—2019年对山东、河北和黑龙江3 家规模化奶牛养殖场的乳房炎奶牛进行了长达2 年的持续跟踪研究，采集6 301 份奶样，分离出183 株肺炎克雷伯菌，2 年间对该菌的分离率较稳定，没有显著性差异。

3 肺炎克雷伯菌的毒力因子

3.1 荚膜多糖

荚膜多糖是由多个重复的寡聚糖衍生物组合形成，松散包裹细胞壁，帮助病菌对抗机体中补体介导的吞噬作用，还可抵抗宿主的非特异性免疫防御机制，也是肺炎克雷伯菌最重要的毒力因子之一。荚膜通常附着在病菌表面，入侵至机体后，荚膜可与菌毛协助作用，促进病菌定植、增殖和迁移[18]。不同个体肺炎克雷伯菌的荚膜不同，这是因为编码荚膜多糖的基因中有一段可变区（CD1-VR2-CD2），通常根据此序列的变化来分型[19]。目前大部分肺炎克雷伯菌株的血清型属于K1和K2，也有研究者对不同血清型的毒力进行检测，发现K1、K2和K5这三种血清型的毒性较强，和某些人畜共患传染病相关[20]。不仅如此，毒力高低还和荚膜多糖产生量相关，有部分菌株毒力增强就是因为荚膜多糖过量产生[21]。病菌感染初期，荚膜多糖可帮助病菌抵抗免疫细胞吞噬，抵御抗菌肽作用，还可抑制早期免疫应答和树突状细胞的成熟[22]。

3.2 脂多糖

脂多糖是革兰氏阴性菌细胞外膜的重要组成部分，由糖、蛋白质和磷脂复合物组成，也被公认为是细菌引起败血性休克的主要原因。其中由于O抗原结构不同分为不同血清型，最主要的为O1、O2和O3三种血清型[23]。脂多糖的变化也会影响细菌对抗菌肽的抵抗作用，且能诱导机体发生炎症反应。

3.3 黏附因子

病菌侵染宿主细胞时，黏附是细菌定植的关键，病菌靠自身的黏附素与宿主表面受体特异性结合，为后续侵袭和繁殖做好基础[24]。肺炎克雷伯菌则通过菌毛完成，主要包括Ⅰ型菌毛、Ⅲ型菌毛和非纤毛型的黏附蛋白。

I型菌毛是由一组Fim（A、B、C、D、E、F、G、H、I）基因群表达，其中Fim H可编码I型菌毛尖端的黏附蛋白的表达[25]。I型菌毛可穿透荚膜向外延伸，调节机体对宿主细胞D-甘露糖的敏感性黏附，且实验证明I型菌毛是引起尿路感染的重要因素。

Ⅲ型菌毛具有甘露糖抗血凝特性，可凝集经鞣酸处理过的红细胞。由Mrk（A、B、C、E、F）基因群编码，其黏附蛋白位于菌毛尖端，由Mrk基因进行编码[26]。Ⅲ型菌毛有利于细菌黏附在机体的呼吸道、消化道和泌尿生殖道等黏膜上皮细胞，且促使宿主表面生成生物被膜。MrkD基因对Ⅲ型菌毛十分重要，缺失 MrkD 后会导致细菌无法结合基质外的成分，生物被膜形成也受到限制[27]。

3.4 铁载体

铁载体是细菌分泌的一种小分子、高亲和力的铁螯合分子，细菌可通过该物质来摄取生长发育所需的铁元素。目前发现在肺炎克雷伯菌中具有4 种铁载体，分别是产气菌素、沙门菌螯铁蛋白、肠杆菌素和耶尔森杆菌素，这些铁载体能使肺炎克雷伯菌生长在低铁浓度环境中。铁载体的不同与宿主的感染部位及严重程度有关，但研究发现，临床上大部分的分离株都具有肠杆菌素，且编码肠杆菌生产的基因与生物被膜的形成息息相关，所以肠杆菌素被认为是病菌主要的铁吸收系统[28]。

3.5 外排泵

外排泵能将病菌细胞中的药物排出，导致药物作用下降，外排泵也通常与肺炎克雷伯菌的抗生素耐药性相关。肺炎克雷伯菌的外排泵较多，主要有RND家族外排泵AcrAB-TolC、OqxAB，MFS家族外排泵KmrA、KdeA、KpnGH，SMR家族外排泵KpnEF，MATE型外排泵KetM[29]。

4 耐药性分析

过去几十年中，肺炎克雷伯菌耐药性急剧增加，除了和药物滥用有关外，也和肺炎克雷伯菌本身特性相关。兽医临床上，在大量抗生素刺激下，肺炎克雷伯菌能产生抗生素水解酶，导致耐药菌株数量不断增加，使该菌防治变得困难。肺炎克雷伯菌对不同抗生素的敏感性具有较大差异，如对氨苄西林具有较好的先天耐药性，这是因为其染色体中存在SHV-1青霉素酶，对其他药物的耐药性则是和染色体位点的突变有关[30]。其中，含有广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌对第3代头孢具有较强耐药性，但对头孢吡肟这类第4代头孢耐药性较差，含有此类酶的病菌对几乎所有的β-内酰胺类抗生素均具有良好耐药性[31]。对碳青霉烯类抗生素的耐药性和肺炎克雷伯菌的ST11、ST14、ST101、ST147和ST258等序列密切相关，这些编码碳青霉烯酶的基因一部分存在染色体上（IMI-1、NMC-A、SME、SHV-38和SFC-1等），一部分存在质粒上（KPC、GES和IMI-2等）[32]。

国外的研究发现，肺炎克雷伯菌的耐药性在逐渐增强。Jong[33]等对欧洲国家奶牛乳房炎样品中的肺炎克雷伯菌耐药性进行分析，发现其对四环素的耐药性为19.5%，对头孢噻呋不具耐药性。曹菲菲[15]等对从乳房炎中分离出的119 株肺炎克雷伯菌的耐药性分析发现，其对胺比西林的耐药性达94.96%。Sanchez[34]等对搜集12 年间的3 132 354 株肺炎克雷伯菌的耐药性进行探索研究，发现对碳青霉烯类药物具有耐药性的肺炎克雷伯菌对四环素和丁胺卡那霉素的交叉耐药性较低，但对其他抗菌药物的耐药性都增加。Otter[35]等对伦敦40 例由肺炎克雷伯菌引起的传染病分析发现，肺炎克雷伯菌在10 个月时间内发生3 次变异，变异后对秋水仙素的耐药率达66%。Sikarwar[36]从印度多个地区收集20 株肺炎克雷伯菌，发现其中54%的菌株具有多种耐药性，60%以上的菌株对氯霉素和四环素具有较好耐药性，28%～76%的菌株对头孢噻肟具有较好耐药性。

有研究者对我国肺炎克雷伯菌的耐药性分析归纳，发现从2005—2017年，肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南的耐药性由3.0%、2.9%上升到20.9%、24.9%，增长迅速[37]。高兴[38]等对212 株肺炎克雷伯菌的耐药性进行对比，发现其对头孢吡肟的耐药性为5.7%，对环丙沙星的耐药性为4.7%，对头孢他啶的耐药性为4.2%，对美罗培南的耐药性为2.8%，对厄他培南的耐药性为0.5%，对亚胺培南和替加环素没有耐药性。贾丽[39]等对32 株肺炎克雷伯菌的耐药性分析发现，对恩诺沙星的敏感率最高，可达96.875%，部分病菌具有多重耐药性，特别是对氨苄西林、多西环素、复方新诺明、头孢唑啉的耐药性较高。

5 总结

用抗生素治疗肺炎克雷伯菌引起的乳房炎是奶牛场最常用的选择，但由于抗生素滥用，导致肺炎克雷伯菌耐药性越来越严重，成为治疗和预防乳房炎的重大难题。肺炎克雷伯菌多种毒力因子和能产生耐药性的特殊机理对防治该菌构建较大困难。因此，要降低肺炎克雷伯菌的危害，应做好其毒力作用机制和耐药性特性的研究，更深入探索肺炎克雷伯菌的耐药机制，更准确指导临床用药，从而更好防防治肺炎克雷伯菌引起的乳房炎，降低其危害。