间苯三酚注射液细菌内毒素法的研究

尚博扬， 王 宁， 翟 宇

（1.宁夏卫生健康职业技术学院，石嘴山 753000； 2.宁夏回族自治区药品检验研究院，银川 750002）

间苯三酚注射液具有缓解痉挛的作用，可用于缓解消化系统和胆道功能障碍引起的急性痉挛和疼痛，临床应用广泛[1-2]。采用热原法对间苯三酚注射液进行安全性检测，需将一定量的被测样品通过静脉注入家兔体内，观察其注射后3 h以内体温升高的情况，以判断所测样品中有无热原存在。此方法有操作繁琐、价格昂贵、重复性差、灵敏度较低、使用活体动物实验等缺点，且不满足现在所提出的“3R”动物福利原则，故已被细菌内毒素法所代替。细菌内毒素凝胶法是利用鲎试剂（TAL）检测革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判定被检测物质是否符合规定的一种方法，此方法操作简便易行、灵敏度比家兔法高10 倍、实验费用低、结果迅速可靠，能真实地模拟人体对热原的反应，现已被广泛应用[3-4]。本研究拟参照《中华人民共和国药典》2020 年版第四部收载的细菌内毒素检查法对该品种替代热原法进行可行性研究。

1 材料与仪器

1.1 供试品及试剂

1.1.1 供试品 间苯三酚注射液（万邦德制药集团有限公司；规格：4 mL∶40 mg；批号：3G2112023、3G211106A、3G211207A）。

1.1.2 TAL 2 批分别购自福州新北生化工业有限公司（规格：0.1 mL/支，批号：22021812，灵敏度：0.25 EU·mL-1）和湛江博康海洋生物有限公司（规格：0.1 mL/支，批号：20220103，灵敏度：0.25 EU·mL-1）；细菌内毒素工作标准品（CSE）购自中国食品药品检定研究院（规格：90 EU/支，批号：150601-202191）；细菌内毒素检查用水（BET）分别购自福州新北生化工业有限公司（规格：5 mL/支，批号：21010105，内毒素含量：＜0.015 EU·mL-1）和湛江博康海洋生物有限公司（规格：5 mL/支，批号：2012020，内毒素含量：＜0.003 EU·mL-1）。

1.2 仪器设备

ZH-2 自动漩涡混悬器（天津药典标准仪器厂）；TW200 电热恒温水浴锅［优莱博技术（北京）有限公司］；OMS60 电热鼓风干燥箱（美国Thermo Fisher 仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 TAL 灵敏度的复核实验

取TAL 2 批（每批18 支）分别加入BET 水0.1 mL 溶解，另取CSE 1 支用BET 水溶解后制备成2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ，共4 个浓度的内毒素标准溶液，用不同浓度的内毒素标准溶液分别与等体积的TAL 溶液混合，每一内毒素浓度平行做4 支；另取2 支加入等体积的BET 水作为阴性对照（NC），依法检查[3]并计算TAL 灵敏度测定值（λc）。计算结果表明，λc 均在0.5～2 λ，结果符合规定，均可用于细菌内毒素检查，见表1。

表1 TAL 灵敏度复核实验结果

2.2 内毒素限值（L）的确定

根据公式L=K/M 确定内毒素限值，《中华人民共和国药典》2020 版第四部规定K 为静脉用药时为5 EU·（kg·h）-1，M 为人均体质量按60 kg 计，该品种每日最大剂量为200 mg，故M=3.3 mg·kg-1；L=K/M=5 EU·（kg·h）-1÷3.3 mg·（kg·h）-1=1.5 EU·mg-1。间苯三酚注射液最大有效稀释倍数（MVD）=C·L/λ=10×1.5/0.25=60 倍（C 为供试品规格；L 为供试品的细菌内毒素限值；λ 为鲎试剂的标示灵敏度）[3]。

2.3 干扰预实验[3-5]

干扰预实验是为正式干扰实验提供依据，以避免实验数据的盲目性及造成试剂的浪费。由于3 批样品的pH 均在4.0 左右，偏酸性会对细菌内毒素与TAL 存在一定的干扰，先用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液将间苯三酚注射液pH 值调节在6.0～8.0，再用BET 水将供试品分别稀释成20、30倍，以及最大稀释倍数60 倍的溶液，每个浓度2支，标记为供试品阴性对照（NPC）；用上述NPC作为稀释液制备2 λ 的供试品溶液，每个浓度2支，标记为供试品阳性对照（PPC）并NC 和细菌内毒素阳性对照（PC），从实验结果得出间苯三酚注射液在30 倍稀释时样品对内毒素与TAL 均无干扰作用，见表2。

表2 间苯三酚注射液干扰预实验结果

2.4 正式干扰实验

取TAL 共2 批，每批72 支，分别加BET 水0.1 mL 溶解，取调节至中性的间苯三酚注射液3批用BET 水稀释30 倍[6]，另取CSE 1 支，分别用BET 水和30 倍稀释液制成2 λ、1 λ、0.5 λ、0.25 λ的BET 水系列和供试液系列，每个浓度4 支；并设2 支BET 水作阴性对照，按照《中华人民共和国药典》2020 年版第四部通则要求依法检查，实验结果表明，所有NC 及BET 水系列溶液的结果均符合实验要求，表明本研究方法可行，根据结果计算用BET 水制成的CSE 的反应终点浓度的几何平均值（Es）［Es=antilg（∑Xs/4）］，和用供试品稀释液制成的CSE 的反应终点浓度的几何平均值（Et）［Et=antilg（∑Xt/4）］均在规定范围之内，Xs、Xt 分别为用BET 水和供试品稀释液制成的CSE 溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。由干扰实验可以看出，Es 值均为0.5～2.0 λ（包括0.5 λ和2 λ），0.5 Es≤Et 值≤2.0 Es 范围，说明将样品稀释成30 倍时样品对TAL 及内毒素无干扰作用，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查，见表3。

表3 间苯三酚注射液干扰实验结果

2.5 细菌内毒素检查

根据干扰实验结果，取TAL 共2 批，每批24支，分别对供试品进行细菌内毒素检查，并同时设立其自身阳性和阴性对照管。结果表明，间苯三酚注射液对TAL 均无干扰，重复性良好，结果均符合《中华人民共和国药典》2020 年版第四部规定的要求，见表4。

表4 内毒素检查结果

3 讨论

在进行干扰预实验时发现PPC 会出现无规律的阴性结果，而NC 和PC 结果均正常，经过排查推测可能是由于间苯三酚注射液pH 值偏酸性造成的。因此，用适宜方法将本品的pH 值调节至7.0 且经过30 倍稀释时再进行干扰预实验PPC 便没有再发生阴性结果。

本品现有法定标准是采用热原检查法对其安全性进行评价，但其方法操作繁琐、灵敏度低、干扰因素多。为了降低药品的安全风险，找到切实可行、简单易做的方法，使该产品目前使用的标准更为严谨[7]，本研究对细菌内毒素检查法进行探索性研究，考察细菌内毒素检查法替代热原检查法的可行性。研究结果表明，该品种对细菌内毒素凝胶法无干扰，此方法无论是特异性还是时效性都优于热原法，可替代热原法进行安全性评价。本研究表明，间苯三酚注射液用BET 水稀释30 倍时，对灵敏度为0.25 EU·mL-1的TAL 无干扰作用，可用于原料及其制剂的质量控制。本研究的方法只适用于万邦德制药集团有限公司生产的该产品，由于不同厂家的生产工艺不同，细菌内毒素干扰因素也不一样，因此对于不同生产厂家生产的间苯三酚注射液，应根据自身实际情况，建立与其相适应的细菌内毒素检查法，确保所建立的方法准确、合理，以便更好地控制产品质量。

4 结论

本研究中的TAL 灵敏度复核实验和干扰实验结果均符合要求，而且用BET 水制成的CSE的反应终点浓度的几何平均值Es 值在0.5～2.0 λ（包括0.5 λ 和2 λ）范围、用供试品稀释液制成的CSE 的反应终点浓度的几何平均值（Et）在0.5～2.0 Es（包括0.5 Es 和2.0 Es）范围内。研究结果表明，本研究为该品种细菌内毒素检查法（凝胶法）的建立提供了参考依据；故将样品稀释成30倍时，选择灵敏度为0.25 EU·mL-1的TAL 进行细菌内毒素检查法代替热原法进行安全性评价可行，结果符合规定，可满足安全需要，且生产厂家的工艺水平完全可以达到此标准，可避免一药多项、一项多限的问题。