人参新品种福星牛性状观测及SSR 分子鉴定

杨忠亮，徐怀友，侯玉兵，张 瑞，雷秀娟，王英平

（1.吉林农业大学 中药材学院，吉林 长春 130118；2.吉林参王植保科技有限公司，吉林 抚松 134500；3.抚松人参质量检测中心，吉林 抚松 134500；4.人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究中心，吉林 长春 130118）

人参（Panax ginseng）为多年生草本植物，是中国传统名贵中药材，具有提高组织抗缺氧能力、抗衰老、抗辐射、抗肿瘤和提高免疫力等多种功效[1-2]。近年来，随着人参产业的不断扩大，人们在追求高效益的同时，忽视了对种源的开发和保护，造成人参种源高度混杂，产品质量参差不齐[3-4]。据考证，中国从清朝便开始了大规模的人参种植[5]，但品种选育工作相对滞后，目前国内仅有23 个人参品种[6-8]。因此，结合产业发展现状，加速种源开发和品种选育工作迫在眉睫。由吉林农业大学和吉林参王植保科技有限公司联合选育的人参新品种福星牛，于2021 年通过吉林省农作物品种委员会审定，审定编号为吉登药2021002。该品种适宜在吉林省白山市、延边州、吉林市等海拔400～900 m、无霜期90～130 d的针阔混交林或低质改造地种植。

SSR（Simple sequence repeats，简单重复序列）具有多态性高、重复性好、操作简单、较表型鉴定品种更具准确性等优点，被广泛应用于作物品种鉴定[9-10]，然而利用SSR 进行人参品种鉴定的研究鲜有报道。鉴于此，拟以人参新品种福星牛为研究对象，以福星2 号、大马牙2 个高产品种为对照，系统分析福星牛人参新品种的表型性状，筛选精准鉴定引物并开展SSR 分子鉴定，为福星牛的推广应用提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 材料与试验地概况

试验于2019 年在吉林省白山市抚松县抽水乡正岔沟村开展，试验品种为福星牛，以福星2 号、大马牙2个高产品种为对照，挑选肥力中等、均匀一致的地块进行试验。3个参试品种采用统一栽培管理技术，2019 年10 月将大小均匀一致、健康的3年生种苗进行移栽，株距10 cm、行距25 cm，每行16 棵，移栽深度为越冬芽至参床表面8 cm。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 植株表型性状测定 参照《人参田间调查记载方法》[11]进行植株表型性状测定，2022年8月每个品种随机选择20 株进行调查，调查指标包括叶长、叶宽、茎高、茎粗、叶厚、单株根鲜质量、主根长和主根粗。叶长、叶宽、茎高和主根长测量精度要求达到0.01 cm，茎粗、叶厚和主根粗测量精度要求达到0.01 mm，单株根鲜质量测量精度要求达到0.01 g。

叶面积=叶片长×叶片宽×0.645 2[11]。

1.2.2 果实表型性状测定 果实表型性状测定方法同1.2.1，于2022 年8 月果实成熟期每个品种随机选择20株进行果实表型性状调查，测定指标包括果穗类型、果穗直径、果穗质量、果穗粒数、果粒长度、果粒宽度和果粒厚度。果穗直径、果粒长度、果粒宽度和果粒厚度测量精度要求达到0.01 mm，果穗质量测量精度要求达到0.01 g。

1.2.3 种子表型性状测定 种子表型性状测定方法同1.2.1，将果实清洗出种子后进行种子表型性状调查，测定指标包括种子百粒质量、单株种子粒数、种子长度、种子宽度和种子厚度。百粒质量测量精度要求达到0.01 g，种子长度、种子宽度和种子厚度测量精度要求达到0.01 mm。

1.2.4 根部产量和根部病害发生情况测定 根部病害病情分级标准同《人参田间调查记载方法》[14]，于2022年9月随机测定3个参试品种5 m2内根部产量和根部病害病情指数。

根病情指数＝（各病害等级根数与相应病害等级乘积之和/调查根数与最高病害等级乘积）×100。

1.2.5 根部人参皂苷含量测定 3 个参试品种根部人参样品经洗刷沥水后置于阴凉通风处，阴干后粉碎过25.4 mm 孔径筛子，利用UltiMate3000 UHPLC液相色谱仪进行根部人参皂苷含量测定。液相条件为DIONEX UltiMate 3000 液相色谱仪（自带UltiMate 3000 自动进样器），采用UNIEX-7700 蒸发光检测器，载气流速为2.5 L/min，温度为75 ℃，增益值为1。检测条件：XBridge C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL。

1.3 SSR鉴定

利用高效植物基因组DNA 提取试剂盒（DP350-02）提取3 个参试品种种子DNA。试验所用的50对SSR 引物[12-16]由上海生工生物工程股份有限公司合成。10 μL PCR 反应体系：2×TaqPCR Master Mix 5.0 μL，正、反向引物各0.5 μL，模板1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，33个循环；72 ℃再延伸5 min。使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）检测PCR 产物，电泳结束后进行银染显色。

1.4 数据处理

采用Excel 2019、SPSS 25、Origin 2021 软件进行数据整理、统计分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 福星牛与对照品种地上植株表型性状比较

地上植株表型性状如表1 所示。由表1 可知，福星牛的叶面积（107.48 cm2）、茎粗（8.03 mm）和叶厚（0.19 mm）均显著高于其他2 个品种（P＜0.05）。福星牛茎高（32.60 cm）与福星2 号差异不显著（P＞0.05），但与大马牙差异显著（P＜0.05）。

表1 福星牛与福星2号、大马牙地上表型性状比较Tab.1 Comparison of aboveground phenotypic traits of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

2.2 福星牛与对照品种果实表型性状比较

福星牛与对照品种果实表型性状如表2 所示。由表2可知，福星牛与对照品种均为伞形果穗，福星牛果穗直径（59.04 mm）和果穗质量（21.09 g）显著高于大马牙（P＜0.05）。福星牛果穗粒数（96.60粒）、果粒长度（9.27 mm）、果粒宽度（6.79 mm）、果粒厚度（5.38 mm）均显著高于福星2 号和大马牙（P＜0.05）。

表2 福星牛与福星2号、大马牙果实表型性状比较Tab.2 Comparison of fruit phenotypic traits of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

2.3 福星牛与对照品种种子表型性状比较

福星牛与对照品种种子表型性状如表3 所示。由表3可知，福星牛种子性状表现优异，不仅种子大小（种子长度5.60 mm、种子宽度4.81 mm）显著大于2 个对照品种（P＜0.05），百粒质量（3.13 g）、单株种子粒数（143.60个）、种子厚度（2.82 mm）也显著高于大马牙（P＜0.05）。

表3 福星牛与福星2号、大马牙种子表型性状比较Tab.3 Comparison of seed phenotypic traits of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

2.4 福星牛与对照品种根部表型性状和根部病害比较

福星牛与福星2号和大马牙的根部表型性状和病害发生情况见表4。由表4 可知，福星牛单株根鲜质量（81.49 g）、主根长（15.96 cm）、主根粗（35.45 mm）和根部产量（3.12 kg/m2）均显著高于2个对照品种（P＜0.05）。在田间自然发病情况下，福星牛红皮病病情指数为15.91，锈腐病病情指数为1.10，均在三者中最低。

表4 福星牛与福星2号、大马牙根部表型性状和根部病害调查Tab.4 Investigation on phenotypic traits and diseases of roots of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

续表4 福星牛与福星2号、大马牙根部表型性状和根部病害调查Tab.4 Investigation on phenotypic traits and diseases of roots of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

2.5 福星牛与对照品种根部人参皂苷含量比较

3 个参试品种根部9 种主要人参皂苷含量如图1 所示。由图1 可知，福星牛9 种皂苷（Rg1、Re、Rf、Rg2、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd）的含量分别为0.85%、0.91%、0.17%、0.22%、0.56%、0.20%、0.31%、0.04%、0.03%，其中Re含量显著高于福星2号和大马牙（P＜0.05）。3 个参试品种有效成分含量均超出了2020版《中华人民共和国药典（一部）》[17]要求的最低标准。其中，福星牛根部人参皂苷Rg1、Re含量合计为1.76%，比2020 版《中华人民共和国药典（一部）》要求的0.30%高出1.46 个百分点；Rb1含量为0.56%，比2020 版《中华人民共和国药典（一部）》要求的0.20%高出0.36个百分点。

图1 福星牛与福星2号、大马牙根部9种人参皂苷含量差异Fig.1 Differences in the content of nine kinds of ginsenosides roots of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

2.6 福星牛与对照品种性状变异分析

福星牛、福星2号和大马牙的表型性状、根部产量、抗性与有效成分含量变异情况见表5。由表5可知，3 个参试品种的30 个性状存在不同程度的变异。地上表型性状中变异系数最高的为茎粗（25.86%），最低的为叶厚（5.56%）。果实表型性状中变异系数最高的为果穗粒数（21.75%），最低的为果穗直径（9.43%）。种子表型性状中变异系数最高的为种子厚度（9.26%），最低的为种子长度（7.68%）。根部表型性状中变异系数最高的为红皮病病情指数（43.04），最低的为单株根鲜质量（11.01 g）。9 种根部人参皂苷含量中变异系数最高的 是Rg2，达69.23%；最 低 的 为Rb3和Rd，均 为33.33%。

表5 福星牛与福星2号、大马牙生物学性状变异分析Tab.5 Variation analysis of biological characters of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

续表5 福星牛与福星2号、大马牙生物学性状变异分析Tab.5（Continued）Variation analysis of biological characters of Fuxingniu，Fuxing 2 and Damaya

2.7 福星牛与对照品种的SSR鉴定

重复性好、多态性高的SSR 核心引物可以用于品种资源鉴定，为了筛选出多态性高的SSR 引物，从50对SSR 引物中筛选出条带清晰稳定、多态性好的引物6 对（表6）。其中，引物Pg83678 可用于快速鉴别福星牛与对照品种，引物Pg83678 对3 个参试品种扩增产物的电泳检测结果如图2 所示。由图2可知，福星牛条带与2个对照品种存在明显差异。

图2 特异引物Pg83678对3个参试品种PCR检测结果Fig.2 PCR results of three tested varieties amplified by specific primer Pg83678

表6 SSR适宜引物序列Tab.6 Sequences of SSR suitable primers

3 结论与讨论

人参的繁殖依赖于种子，种子的大小对下一代人参的根部产量有直接影响。王桂郁[18]的研究表明，大种子的种胚更大，胚原基发育良好，但小种子胚长值小，裂口率低。ZHANG 等[19]的研究表明，大种子表现出显著的出苗率，种子越大，主根长、单株根鲜质量和3年生人参根部产量越大。这可能是因为较大的种子含有更多的营养和能量，可在子叶独立光合作用之前分配更多的资源用于早期生长。本研究中，福星牛种子长度和种子宽度显著高于其他品种（P＜0.05），为大粒人参种子。在后续的品种推广中，可以有针对性地进行推广。

人参的商品性很强，其经济效益直接取决于根部产量，在中国人参品种中，吉参1号[20]、福星2号是高产代表。本研究3 个品种中，福星牛根部产量可达3.12 kg/m2。人参锈腐病和人参红皮病是常见的人参根部病害，对人参的根部产量和品质均有影响，中国人参品种中，中农皇封参对连作常见的人参锈腐病和人参红皮病具有很强的抗性[21-22]。本研究中的3 个品种中，福星牛的锈腐病病情指数和红皮病病情显著低于2个对照品种（P＜0.05）。

根部人参皂苷含量的高低是衡量人参品质的重要指标。Rb1具有抑制中枢神经、催眠、镇痛、解热、促进血清蛋白合成等作用，抑制中性脂肪的分解及促进胆固醇的合成[23]；Rb2具有促进脑中枢调节、抑制中枢神经系统、消除体内自由基、改善心肌缺血再灌注损伤的功效[24]；Rb3具有修复高血压患者受损的动脉血管内皮的功效[25]；Rc 是甾体分子，抑制癌细胞的增殖，可增加精子的运动能力；Rd 可增强免疫受抑小鼠的细胞功能；Re 抑制中枢神经，促进RNA、DNA 合成；Rg1具有兴奋中枢神经、促进疲劳恢复、促进RNA 和DNA 合成的功效；Rg2有抑制血小板凝集的作用；Rf 具有镇痛和抗炎的作用[26]。本研究首次对福星牛、福星2 号和大马牙根部9 种主要皂苷含量进行了对比，其中福星牛Re含量显著高于2个对照品种（P＜0.05）。

性状的变异频率是性状遗传多样性量化指标，变异系数越大，优良资源选择的余地越大。3个参试品种间茎、叶、果实、根部和人参皂苷含量的部分性状变异系数超过10%，说明3 个参试品种间表型存在差异。表型性状易受外界环境等因素的影响，仅通过表型性状对其鉴定区分难度较大。因此，育种工作中需要结合DNA 分子标记进行快速精准鉴定，选育优良人参品种。SSR具有多态性高、重复性好、操作简单、较表型鉴定更准确等优点，在其他作物品种鉴定中应用较多，然而利用SSR 进行人参品种鉴定的研究鲜有报道。本研究中，共筛选出6 条条带清晰稳定、多态性好的适宜引物，其中，引物Pg83678可用于快速鉴别福星牛与对照品种。

人参育种较其他作物起步晚，目前，人参育种主要采用集团选育[27]。但集团选育需要对现有遗传资源进行收集和筛选，并不能将不同品种的优良基因进行组合，且育种周期长，在品种优化上难以有较大的创新与突破。随着生物技术手段的不断进步和研究的不断深入，在后续的品种改良和品种选育工作中，应加大杂交育种和分子标记辅助育种技术的研究力度，在利用分子标记技术构建人参遗传连锁图谱的同时，挖掘更多人参资源的遗传信息，开发优良性状的分子标记，在培育高产、抗病、优质人参新品种的同时，为推进人参育种进程做出贡献。