牛源肝素钠的工艺研究与结构分析

刘力波，田志鹏，李志敏

（河北常山生化药业股份有限公司，河北石家庄 050800）

0 引言

肝素钠在临床上，主要用于预防血栓形成和栓塞，以及治疗各种原因引起的弥散性血管内凝血。牛源肝素钠区别于目前最广泛使用的猪源肝素钠，从牛肠黏膜提取。据UNFAO 2013年官方统计数据表明，全球活牛数量（包括家养牛和水牛） 约为17 亿头，而全球活猪数量约为10 亿头[1]，牛的数量是猪数量的1.7 倍，牛源肝素钠具有更为广阔的原料来源。牛源肝素粗品含有核酸、蛋白质、硫酸皮肤素和硫酸软骨素等杂质，精制过程主要是对粗品肝素进行去杂质和脱色。国内目前纯化肝素的方法主要采用高锰酸钾氧化法、过氧化氢- 高锰酸钾组合氧化法、过氧化氢二次氧化法[2]。但是，高锰酸钾氧化会在H 谱的2.10 mg/L 处出现一个特征信号峰[3]，存在可能不符合药典标准的问题，而且高锰酸钾氧化过程中会产生大量难以过滤的二氧化锰絮状物，工艺操作复杂。而双氧水氧化后分解成水和氧气，是相对清洁的氧化剂。相较于多次氧化，单次双氧水氧化工艺的生产周期短，更为节省物料，有利于企业控制成本。为了通过单次氧化既完成脱色任务，又不会因氧化过强而过多损失收率，这就需要设计正交试验，挑选出最适宜的工艺参数。着重描述了最优氧化工艺的筛选过程，并对精制的牛源肝素钠进行了结构分析。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

牛源粗品肝素，Wegmed 公司提供；肝素钠标准品，中国药品生物制品检定所提供；绵羊血浆，东营博丰生物科技有限公司提供；过氧化氢、氯化钠、氯化钙、盐酸、氢氧化钠和过氧化氢，均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器

UV-8000 型紫外- 可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产品；DK-98-ⅡA 型恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司产品；PB-10 型PH 计，Sartorius 公司产品；DZF-6210 型真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；S22-2 型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司产品；PL602-L 型电子天平，Mettler Toledo 公司产品；JB300-D 型电动搅拌机，上海标本模型厂产品；E2695 型高效液相色谱仪，美国沃特斯公司产品；U3000 型高效液相色谱仪，美国赛默飞公司产品。

1.3 方法

1.3.1 检测方法

肝素钠效价测定采用羊血浆法[4]，二糖测定参照Mourier P的方法[5]，分子量测定参照Fu L等人[6]的方法。将肝素精品的水溶液进行全波长扫描，发现溶液在400 nm 处有一个吸收峰值，因此将色素的检测波长定为400 nm。

1.3.2 脱色率和效价收率的计算方法

式中：A前、A后——样品脱色前后的吸光度。

式中：M1——氧化前质量，g；

P1——氧化前效价；

M2——氧化后质量，g；

P2——氧化后效价。

1.3.3 单因素试验

取经盐解、高温、离子交换、乙醇沉淀等步骤处理的沉淀物20 g，加纯化水溶解至200 mL，进行氧化步骤；氧化结束后，调药液pH 值为6.0～7.0，加入乙醇使药液乙醇体积分数为70%；乙醇沉淀16 h 后，将沉淀物烘干，对沉淀干燥品进行效价和吸光值检测；分别考查反应温度、反应pH 值、双氧水添加量、反应时间对脱色率和效价收率的影响。

1.3.4 正交试验

将氧化步骤的反应温度、反应pH 值、双氧水加量、反应时间作为影响因素，以脱色率和效价收率为考查指标，设计四因素三水平L9（34）正交试验。

氧化反应条件影响试验正交因素与水平设计见表1。

表1 氧化反应条件影响试验正交因素与水平设计

1.3.5 牛源肝素钠制备工艺

工艺首先通过盐解与高温处理将一部分蛋白质与多糖分离；然后用阴离子树脂进行吸附，再用低浓度NaCl 溶液洗涤除去大量蛋白质、核酸，用高浓度NaCl 溶液洗脱得到肝素溶液，并进行乙醇沉淀除去硫酸皮肤素和硫酸软骨素；随后将沉淀物溶解进行氧化，再经乙醇沉淀、冻干，获得效价较高、色泽良好的牛源肝素钠精品。盐解、高温处理、离子交换和乙醇沉淀的工艺步骤与传统的肝素钠生产方法[7]基本一致，冻干的参数采用公司经过验证的参数。

牛源肝素钠制备工艺流程见图1。

图1 牛源肝素钠制备工艺流程

2 结果与分析

控制合适的氧化条件，才能使得色素被充分的去除，而牛源肝素的结构不受影响。根据文献[8-9]报道并结合实际，确定影响脱色率和效价收率的关键参数为反应温度、反应pH 值、双氧水加量、反应时间。

2.1 双氧水加量对脱色率和效价收率的影响

固定反应温度60±2 ℃，反应pH 值10.0±0.2，反应时间6 h，进行不同双氧水添加量对脱色率和效价收率的影响。

双氧水添加量对脱色率和效价收率的影响见图2。

图2 双氧水添加量对脱色率和效价收率的影响

由图2 可知，双氧水添加量达到2%后，脱色率达到顶点，而效价收率随着添加量升高缓慢下降，2%是一个较优的双氧水添加量。

2.2 反应温度对脱色率和效价收率的影响

固定反应pH 值10.0±0.2，双氧水添加量2%，反应时间6 h，进行不同反应温度对脱色率和效价收率的影响。

反应温度对脱色率和效价收率的影响见图3。

图3 反应温度对脱色率和效价收率的影响

由图3 可知，反应温度达到50 ℃后，脱色率上升变得缓慢，而效价收率随着温度升高持续下降，50 ℃是一个较优的反应温度。

2.3 反应pH 值对脱色率和效价收率的影响

固定反应温度50±2 ℃，双氧水加量2%，反应时间6 h，进行不同反应pH 值对脱色率和效价收率的影响。

反应pH 值对脱色率和效价收率的影响见图4。

图4 反应pH 值对脱色率和效价收率的影响

由图4 可知，反应pH 值达到10 后，脱色率达到顶点，而效价收率随着pH 值升高持续下降，pH值为10 是一个较优的反应pH 值。

2.4 反应时间对脱色率和效价收率的影响

固定反应温度50±2 ℃，反应pH 值10.0±0.2，双氧水添加量2%，进行不同反应时间对脱色率和效价收率的影响。

反应时间对脱色率和效价收率的影响见图5。

由图5 可知，反应时间达到6 h 后，脱色率不再上升，而效价收率随着反应时间延长持续下降，6 h是一个较优的反应时间。

图5 反应时间对脱色率和效价收率的影响

2.5 氧化反应条件的优化

在单因素试验的基础上进行正交试验，对比脱色率和效价收率。

氧化反应条件及结果见表2。

表2 氧化反应条件及结果

根据表2 中的极差R 值，对脱色率影响程度的顺序是双氧水加量＞反应温度＞反应pH 值＞反应时间，对效价收率影响程度的顺序是反应温度＞反应pH 值＞反应时间＞双氧水加量。双氧水加量对脱色率影响排第1 位，取最优双氧水加量2.5%；反应温度对效价收率影响排第1 位，取最优反应温度40±2 ℃；反应pH 值对效价收率影响排第2 位，对脱色率排第3 位，取对效价收率影响的最优反应pH 值9.0±0.2；脱色率和效价收率的最优反应时间均为6 h。

2.6 较优工艺条件试验

选择3 批牛源粗品肝素，按照研究筛选的最优牛源肝素生产工艺，制备3 批牛源肝素钠试验样品，进行效价、核酸杂质、蛋白质、分子量等项目检测。

检测结果见表3。

表3 检测结果

N-1，N-2，N-3 这3 批牛源肝素钠试验的脱色率依次为94.3%，94.7%，94.8%，平均为94.6%；氧化步骤的效价收率依次为97.5%，97.2%，97.3%，平均为97.3%。效价、杂质含量、分子量等指标均符合标准要求，总的效价收率也大于90%，说明该工艺稳定且高效。

2.7 牛源肝素钠的二糖结构分析

对N-1，N-2，N-3 这3 批牛源肝素钠试验样品进行二糖进行检测。

二糖分布检测结果见表4。

表4 二糖分布检测结果

ΔGlyser 峰表征肝素中的丝氨酸残基，其可被强氧化剂氧化成ΔGlyser ox1 峰，ΔIVSgal 和ΔIISgal结构源于- IdoA（2S）- GlcNS（6S）- 和- IdoA（2S）-GlcNS- 在碱性条件下2- O- 脱硫[10]，这2 个结构的含量可以反映肝素是否经历过高碱性条件，工艺没有高碱处理步骤，所以样品的这2 个峰较低。ΔUA（2S）-GlcNS 峰和ΔUA（2S）-GlcNS（6S）峰可以用来辨别肝素的来源，牛源肝素的ΔUA（2S）- GlcNS 峰显著高于猪源肝素[11]，ΔUA（2S）-GlcNS（6S）峰的含量与肝素的效价相关，牛源肝素的效价明显低于猪源肝素就与该峰较低有关。

3 结论

经设计正交试验方案，并对试验结果分析研究得出氧化步骤的最佳反应条件为反应温度40±2 ℃，反应pH 值9.0±0.2，双氧水添加量2.5%，反应时间6 h。按最优氧化条件进行试验，该步骤的脱色率为94.6%，效价收率为97.3%。制备的牛源肝素钠效价、杂质含量、分子量等指标均符合标准要求，总的效价收率也大于90%，说明该工艺稳定且高效。

对牛源肝素钠进行二糖结构分析，ΔGlyser 峰较高，ΔGlyser ox1 峰较低，ΔIVSgal 和ΔIISgal 峰含量较低，表明牛源肝素钠结构未被破坏，控制合适的氧化条件，才能使得色素被充分去除，而结构不受影响。ΔUA（2S）-GlcNS 峰较猪源肝 素低，ΔUA（2S）-GlcNS（6S）峰较猪源肝素高，表现出牛源肝素的特征。从二糖结构看，牛源肝素与猪源肝素的结构存在着较大差异，与文献报道一致[12]。