红橘皮酵素加工工艺优化及其特性研究

孟 琦，邱 迁，阎 睿，2，黄文平，2，周文钊，李金金，张帮奎，张 华

（1. 重庆三峡学院生物与食品工程学院 重庆市渝东北特色生物资源开发利用工程技术研究中心，重庆 404120；2. 重庆市万州食品药品检验所，重庆 404100；3. 重庆汇达柠檬科技集团有限公司，重庆 402600）

红橘（Citrus reticulata Blanco） 源于芸香科（Rutaceae） 柑橘属（Citrus L.） 柑橘种（Citrus reticulata）[1]，英文名（Tangerine）。红橘皮含有多糖[2]、橘皮苷[3]、柠檬烯[4]等多种活性成分，具备抑菌[5]、抗氧化[6]等生理活性。酵素是以动物、植物、菌类等为原料，添加或不添加辅料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分（经发酵制得的对生命现象有影响的微量或少量物质） 的产品[7-8]。红橘在加工利用中，主要用于陈皮制备的原料[9]，而其他种类开发产品种类少[10]及附加值低的问题[11]，试验拟利用红橘皮制备一款红橘皮酵素，研究其发酵工艺、生物活性功能成分及其安全性，旨在为红橘综合利用开发提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

红橘，购自重庆市万州区太龙镇；保加利亚乳杆菌1×1010CFU/g、嗜热链球菌1×1010CFU/g、嗜酸乳杆菌1×1010CFU/g、青春双歧杆菌1×1010CFU/g，山东中科嘉亿生物工程有限公司提供；活性干酵母菌1×1010CFU/g，安琪酵母股份有限公司提供；纤维素酶10 万U/g，和氏璧生物科技有限公司提供；果胶酶5 万U/g，南宁庞博生物技术有限公司提供；七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、亚硝酸钠、磷酸二氢钾，成都市科龙化工试剂厂提供；30%过氧化氢（H2O2），重庆市川东化工（集团） 有限公司提供；2,2 - 联苯基- 1 - 苦基肼基（DPPH），武汉塞维尔生物科技有限公司提供；无水乙醇，重庆市川东化工（集团） 有限公司提供；水杨酸，成都新都区木兰工业开发区提供；过硫酸钾，优耐德引发剂（上海） 有限公司提供；氨基酸检测试剂盒BC1570、芦丁标准品、福林酚，北京索莱宝科技有限公司提供；无水葡萄糖标准品，合肥博美生物科技有限责任公司第一分公司提供；氢氧化钠，上海易恩化学技术有限公司提供；碳酸钠，国药集团化学试剂有限公司提供；硝酸铝，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；麦芽糖标准品、半乳糖醛酸标准品、（DNS溶液） 3-5 - 二硝基水杨酸溶液、总SOD 活性检测试剂盒（NBT 法），上海桥星贸易有限公司提供；菌落总数测试片，海盐瑞科仪器厂提供；大肠杆菌技术测试片、金黄色葡萄球菌测试片、沙门氏菌测试片、黄曲霉素B1 测试片，广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司提供；镉（Cd）、铬（Cr）、铅（Pb）、砷（As）、汞（Hg） （以上标品质量浓度均为1 000 μg/mL），国家有色金属及电子材料分析测试中心提供；浓硝酸、浓盐酸、氢氟酸（均优级纯），成都金山化学试剂有限公司提供。

1.2 试验主要仪器设备

全自动高压蒸汽灭菌锅G154DWS；致微仪器公司产品；FA2004 型电子天平，上海津平科学仪器有限公司产品；精密天平，梅特勒托利多科技（中国）有限公司产品；HGZF-11-101-0 型电热恒温鼓风干燥箱、S.SW-CJ-1FD 型净化工作台、ZXGP- A2270型十段编程隔水培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司产品；HSY-24 型恒温水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司产品；TG16-WS 型台式高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品；SUS 304 型皇冠高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品；PHS25 型数显酸度计（精度为0.01 pH 值），上海越平科学仪器有限公司产品；酒精计，衡水正旭电子科技有限公司产品；QYRO-500L 型500 L/h 纯水设备，重庆前沿水处理设备有限公司产品；UV-1100D 型紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司产品；BIO-RAD iMark 伯乐酶标仪，伯乐生命医学产品（上海） 有限公司产品；EXPEC 7000 型电感耦合等离子体质谱仪，聚光科技（杭州） 股份有限公司产品；AFS-9750 型原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公产品；MARS6 高压微波消解仪，美国CEM 公司产品；SQP Sartorius 万分之一电子天平，德国Sartorius 公司产品。

1.3 工艺流程及操作过程

具体操作为橘皮烘干后打粉、过筛，并按比例加入纤维素酶、果胶酶及无菌水，充分混合，并在500 W 下进行超声酶解，之后在75 ℃，15 min 条件下进行巴氏灭菌。灭菌后发酵液依据试验需要进行发酵。期间以羟基自由基清除率为检测指标。发酵后的酵素液经离心过滤，即得到红橘皮酵素。

1.4 红橘橘皮干粉的制备

将红橘清洗、剥皮，将红橘皮在50 ℃恒温下鼓风干燥3 d，粉碎，保存置干燥器内备用。

1.5 红橘皮酵素加工工艺优化

1.5.1 菌种筛选试验

量取100 mL 无菌水并加入0.8 g 橘皮粉，0.2 g果胶酶和0.6 g 纤维素酶，摇匀后进行酶解，在50 ℃，500 W 下超声酶解30 min，之后在75 ℃下巴氏灭菌30 min。冷却后在无菌环境下分别加入青春双歧杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌各0.5 g，于40 ℃条件下进行发酵3 d。

1.5.2 橘皮粉添加量试验

量取100 mL 无菌水，分别加入0，0.2，0.5，0.8，1.2，1.5 g 橘皮粉，摇匀后加入0.2 g 果胶酶和0.6 g 纤维素酶在50 ℃，于500 W 下超声酶解30 min。将酶解液于75 ℃下巴氏灭菌30 min 后冷却至室温，采取自然发酵方式，于40 ℃条件下发酵3 d。

1.5.3 发酵周期的确定

量取100 mL 无菌水加入0.8 g 橘皮粉，摇匀后加入0.2 g 果胶酶和0.6 g 纤维素酶进行酶解，于50 ℃，500 W 条件下超声30 min。再将酶解液于75 ℃下巴氏灭菌30 min。冷却后于40 ℃条件下进行自然发酵1，2，3，6，9，12 d。

1.5.4 超声酶解时间的确定

量取100 mL 无菌水，加入50 ℃恒温鼓风干燥3 d 的橘皮粉0.8 g，摇匀，加入0.2 g 果胶酶和0.6 g纤维素酶进行超声酶解，于500 W 下超声0，40，80，120，160，200 min。再将样品于75 ℃下巴氏灭菌30 min，冷却后于40 ℃条件下自然发酵3 d。

1.5.5 过筛粒径的确定

量取100 mL 无菌水，将橘皮粉分别过0，10，20，40，60，80 目筛，之后取过筛后皮粉0.8 g，加入0.2 g 果胶酶和0.6 g 纤维素酶于50 ℃下进行酶解，酶解后于500 W 下超声30 min。将酶解超声后的样液于75 ℃下巴氏灭菌30 min 后冷却至室温，于40 ℃环境温度条件下自然发酵3 d。

1.5.6 红橘皮酵素正交试验设计

在单因素试验的基础上，选择影响红橘皮酵素抗氧化活性的4 个因素，进行四因素三水平正交试验。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计

1.6 羟基自由基清除能力测定

羟基自由基清除能力的测定方法采用水杨酸法[12]。

1.7 感官评价、酒精度和pH 值测定

红橘皮酵素感官的测定方法参考赵镭等人[13]的文献对其外观（色泽、透明度、状态、表面质地）、气味（香气、香味）、黏度进行评价。酒精度使用酒精测量计测定，pH 值使用酸碱度测试仪进行测定。

1.8 生物活性、营养物质含量的测定

总酸含量的测定方法参考朱娜娜等人[14]的方法；总黄酮含量的测定方法参考魏永生等人[15]的方法；总酚含量的测定方法参考宁志雪等人[16]的方法；α - 淀粉酶活力的测定方法、果胶酶活力的测定方法、纤维素酶活力的测定方法参考秦宇蒙等人[17]的方法；总SOD 酶活力的测定方法采用氮蓝四唑（NBT） 显色法，按照其试剂盒说明书操作；氨基酸含量的测定采用可见分光光度法，按照其试剂盒说明书操作。

1.9 微生物、黄曲霉素B1 和重金属测定

微生物检测采用菌落总数测试片、大肠杆菌技术测试片、金黄色葡萄球菌测试片、沙门氏菌测试片，对酵素是否受到霉菌污染采用黄曲霉素B1测试片进行测试，重金属污染限量测定方法参考黎海灵等人[18]的方法。

2 结果与分析

2.1 红橘皮酵素制备单因素试验结果分析

2.1.1 不同菌种对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

不同菌种对红橘皮酵素抗氧化活性的影响见图1。

图1 不同菌种对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

由图1 可知，不同菌种比较试验后，红橘皮酵素的羟基自由基清除率为（74.16%±0.21%） ～（76.73%±0.15%），存在显著性差异（p＜0.05），但是差异不明显。并且其与空白组比较无明显提升作用，故自然发酵为最适发酵方式。试验中羟基自由基清除率与张海燕等人[19]的苹果自然发酵酵素相似，表明原材料红橘皮同样适合利用自然发酵方式生产酵素。

2.1.2 不同橘皮粉质量浓度对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

橘皮粉质量浓度对红橘皮酵素抗氧化活性的影响见图2。

图2 橘皮粉添加量对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

由图2 可知，不同橘皮粉添加量试验后，红橘皮酵素的羟基自由基清除率为（49.09%±0.46%） ～（69.74%±0.73%），存在显著性差异（p＜0.05）。质量浓度为1.5 g/100 mL 时清除效果最佳为69.74%±0.73%，羟基自由基清除率最大值是最小值的1.45 倍，差值约为21.84%。可见橘粉质量浓度为1.5 g/100 mL时达到最优。

2.1.3 不同发酵周期对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

发酵时间对红橘皮酵素抗氧化活性的影响见图3。

图3 发酵时间对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

由图3 可知，不同发酵周期试验后，红橘皮酵素的羟基自由基清除率为（19.75%±5.10%） ～（71.60%±0.74%），存在显著性差异（p＜0.05），发酵周期为2 d 时达到最优。羟基自由基清除率最大值是最小值的4.94 倍，故最佳发酵周期为2 d。

2.1.4 不同超声酶解时间对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

不同超声时间对红橘皮酵素抗氧化活性的影响见图4。

图4 不同超声时间对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

由图4 可知，不同超声酶解时间试验后，结果显示红橘皮酵素的羟基自由基清除率为（61.43%±0.10%） ～（72.26%±0.59%），存在显著性差异（p＜0.05）。超声时间为120 min 时达到最优。羟基自由基清除率最大值是最小值的1.19 倍，表明超声酶解时间为120 min 时对红橘酵素的抗氧化作用有提高。

2.1.5 不同过筛粒径对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

不同过筛粒径对红橘皮酵素抗氧化活性的影响见图5。

图5 不同过筛粒径对红橘皮酵素抗氧化活性的影响

由图5 可知，不同过筛粒径试验后，红橘皮酵素的羟基自由基清除率为（58.81%±0.51%） ～（65.18%±0.12%），存在显著性差异（p＜0.05）。过筛粒径为40 目筛时达到最优。可见最佳过筛粒径为40 目筛。与张越等人[20]的燕麦酵素最适过筛粒径60 目近似，因而原材料的粒径大小对红橘皮酵素抗氧化活性有影响。

2.2 红橘皮酵素正交试验及验证结果分析

发酵工艺优化正交试验结果见表2。

表2 发酵工艺优化正交试验结果

由表2 可知，在添加纤维素酶0.2 g、果胶酶0.6 g，发酵温度30 ℃条件下，最佳酶解工艺为A3B2C3D3，即橘皮粉质量浓度为0.8 g/100 mL，过筛粒径为60 目，超声酶解时间为160 min，发酵周期为3 d，各因素对羟基自由基清除率的影响程度依次为D＞C＞A＞B。

发酵工艺优化正交试验显著性差异结果见图3。

由表3 可知，橘皮粉质量浓度、过筛粒径、超声酶解时间、发酵周期有显著影响，且差异达到极显著水平（p＜0.01）。

表3 发酵工艺优化正交试验显著性差异结果

为验证正交优化试验所得工艺是否最佳，分别进行3 次平行验证试验。结果表明，红橘皮酵素的羟基自由基清除率平均值为69.34%，RSD≤0.02%，与正交优化最佳试验结果68.49%±0.34%条件相比数值接近，说明该工艺稳定可靠。

2.3 感官评价、酒精度和pH 值检测

感官评价显示红橘皮酵素总体颜色微黄泛橙，澄清透亮，呈液体状，液面无杂质，有熟制橘果香气和发酵香味，不黏稠，质地均匀。通过一般理化指标测定，红橘皮酵素pH 值平均值在3.42±0.01，与付龙威等人[21]的枇杷酵素稳定于3.5 左右的pH 值持平；酒精度平均在0.27±0.06 g/100 g，小于食用植物酵素一般理化指标中液态酵素乙醇含量≤0.5 g/100 g 的规定[22]，均符合国家轻工业局的推荐性行业标准。

2.4 生物活性成分营养物质检测结果与分析

试验结果显示，红橘皮酵素总酸含量平均值9.6±5.6 g/kg最低值为6.4 g/kg，与黄宁馨[23]的植物乳杆菌枸杞发酵液总酸含量6.74 g/kg 相近，红橘皮酵素的总酸含量最高值15.2 g/kg 与魏雪琴等人[24]的陈酿玫瑰酵素的17.02 g/kg 相差1.82 g/kg，究其原因是随时间延长陈酿酵素发酵程度较红橘皮酵素更加丰富。

总黄酮质量浓度为0.309±0.001 μg/mL，总酚质量浓度为3.139±0.025 mg/mL，是无花果酵素[25]总酚质量浓度最大值0.228 mg/mL 的13.77 倍，考虑原因是红橘皮酵素关键材料红橘酚酸类物质较多。总氨基酸质量浓度平均值为0.346±0.03 mg/mL，相较程勇杰等人[26]的柘树叶酵素最高氨基酸质量浓度1.231 mg/mL 低，可能是红橘皮酵素所采用材料为果皮，且在制备过程种进行过巴氏灭菌。

超氧化物歧化酶（SOD） 酶活力为1 410.96±0.899 U/mL，与綦菲等人[27]的红豆越橘发酵底物SOD酶活力1 488 U/mL 结果近似，说明红橘皮酵素确存SOD 酶活力。α- 淀粉酶活力130.306±0.000 2 U/mL，果胶酶活力1 176.033±0.087 U/mL，纤维素酶活力为66.407±0.015 8 U/mL，与番茄酵素[28]的淀粉酶活力79.289 U/g，果胶酶活力最大值3.733 U/g，纤维素酶活力38.180 U/g 相比，红橘皮酵素均展现出较优的效果。

2.5 致病微生物检验和重金属含量检测

通过微生物及毒素检测分析可知，优化后酵素所含的有效活菌数为2.1×104CFU/mL；未检出大肠杆菌大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、黄曲霉素B1。通过重金属限量分析可知，自然发酵优化后的红橘皮酵素中铅含量平均值为0.007 8±0.001 87 mg/kg；总砷含量平均值为0.002 8±0.000 97 mg/kg；镉含量平均值为0.006 6±0.001 93 mg/kg；未检出铬和汞，均符合食品安全指标污染物限量的国家标准[29]。结果表明，红橘皮酵素微生物安全性和重金属限量安全良好。

3 结论

以羟基自由基清除率为抗氧化活性指标，通过单因素试验和正交试验确定红橘皮酵素的最佳工艺。红橘皮酵素较优配比为橘皮粉质量浓度0.2 g/100 mL，过筛粒径60 目，超声酶解时间160 min，发酵周期3 d。根据该配方工艺制备红橘皮酵素，羟基自由基清除率可达69.34%，总酸含量可达6.4～15.2 g/kg，总黄酮质量浓度平均值为0.309 μg/mL，总酚质量浓度平均值可达3.139 mg/mL，SOD 酶活力平均值可达1 410.96 U/mL，α- 淀粉酶活力平均值可达130.306 U/mL，果胶酶活性平均值可达1 176.033 U/mL，总氨基酸含量平均值为0.346 mg/mL，有效活菌数为2.1×104CFU/mL。未检出大肠杆菌大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、黄曲霉素B1，铅、总砷、镉、铬、汞五项重金属指标也均符合国家标准。