树莓果油抑制UVB诱导HaCaT细胞光老化的作用研究

王学红,尹星星,陆 杰,晁 沐,杨永晶

(1.青海大学生态环境工程学院,西宁 810016;2.青海树莓农林产业化有限公司,青海 湟源 812199)

【研究意义】皮肤癌是常见的恶性肿瘤之一。近年来,由于受到环境污染和臭氧层破坏的影响,全球皮肤癌的发病率呈逐年上升趋势[1-2]。研究表明,紫外线中的中波紫外线(Ultraviolet B,UVB)是诱发皮肤癌的重要因素之一[3]。UVB能量较强,穿透能力较浅,主要影响皮肤表皮细胞,其引起皮肤老化的机制主要包括以下几个方面:①破坏皮肤细胞外基质组成,产生基质金属蛋白酶。在皮肤的细胞外基质中,I型胶原蛋白是含量最高的一种功能蛋白,对于维持皮肤弹性具有重要意义,且其含量可作为判断皮肤老化程度的标准[4-5]。当皮肤受到紫外线刺激时,基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)被激活并影响细胞外基质成分[6]。其中,基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3,MMP-3)会协同基质金属蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)降解胶原蛋白,最终导致皮肤中细胞外相关基质成分的结构改变和功能丧失,使皮肤失去弹性、形成皱纹,过早老化[7]。②引起皮肤炎症。UVB能诱导皮肤角质层中白细胞介素(Interleukin,IL)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的生成,引起皮肤炎症。这些炎性细胞因子促使生成过多的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),加剧皮肤细胞的氧化应激,而过多的ROS进一步介导炎性因子分泌,加剧皮肤光老化[8]。此外,炎症因子还能加快MMPs的活化,加快皮肤胶原蛋白的降解,从而加速皮肤老化[9]。③加剧皮肤细胞氧化应激。长期暴露在UVB下,会导致皮肤细胞中自由基的过度产生和抗氧化物的缺乏,最终导致皮肤细胞的氧化损伤[10]。而维持体内的氧化还原稳态有赖于由抗氧化酶和非酶类抗氧化物组成的抗氧化系统[11]。由此可见,防止皮肤的细胞外基质降解、缓解炎症反应和对抗氧化应激是抑制UVB造成皮肤光老化的有效途径。【前人研究进展】传统防晒剂包括化学吸收剂和物理防晒剂。化学吸收剂对人体存在潜在危害,也对环境有着很大的负面影响。物理防晒剂亦存在口鼻吸入和光催化活性等安全隐患[12]。因此,寻找安全有效、绿色环保的天然防光老化物质是防晒技术领域的重要关注点[13]。现今,多种天然新型植物油脂被人们广泛地开发和利用,这些植物油脂在满足人体营养和健康所需的同时在心脑血管疾病的预防、血脂的降低、癌症的抑制和抗氧化等方面也有明显的作用[14]。此外,很多天然植物油脂具有确切的抗光老化活性,如沙棘籽油可有效防止角质形成细胞中由紫外线引起的氧化还原平衡紊乱和脂质代谢异常[15];红花籽油在UVB诱导的人永生化角质形成细胞(Human keratinocytes,HaCaT)细胞中能从蛋白和mRNA水平降低MMP-1的表达[16];紫苏籽油因其较强的紫外吸收能力可添加在防晒护肤品中[17]等。【本研究切入点】树莓(RubusideausL.)为蔷薇科悬钩子属浆果,富含维生素、蛋白质、氨基酸、多糖、多酚、甾体、黄酮、萜类等多种营养物质和生物活性成分[18]。前期研究发现,树莓果油的不饱和脂肪酸占总脂肪酸含量的95%以上[19],是一种极具开发前景的新型天然植物油脂。目前,关于树莓果油的活性研究主要有抗氧化和抗疲劳[19-20],而关于其抗光老化活性的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究采用超临界CO2流体萃取技术提取树莓果油,并利用气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析其化学成分,进一步明确其活性的物质基础。在HaCaT细胞UVB光老化模型中,通过检测UVB光损伤HaCaT细胞的存活率以及细胞中炎症因子、细胞外基质成分和抗氧化因子的含量来评价树莓果油的抗光老化活性,旨在为研发新的抗UVB天然活性物质提供参考,为树莓果油的进一步开发和利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HaCaT细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司,树莓冷冻果由青海树莓农林产业化有限公司提供。

1.2 试剂

胰蛋白酶、PBS缓冲液、HaCaT专用培养基、MEM培养基、青霉素-链霉素混合液、DMSO、胎牛血清购于武汉普诺赛生命科技有限公司;增强型细胞活力检测试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;MMP-3、COL1A1(Collagen type 1)、IL-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6(Interleukin-6,IL-6)、TNF-α、Trx(Thioredoxin,Trx)酶联免疫吸附测定(Enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)试剂盒、RIPA细胞裂解液购自于武汉博士徳生物工程有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒购自于南京建成生物研究所。

1.3 仪器与设备

DHG-9240A鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司;DFY-400A高速万能粉碎机购自无锡沃信仪器有限公司;超临界CO2流体萃取机购自南通市华安超临界萃取有限公司;HF100三气培养箱购自上海力申科学仪器有限公司;SW-CJ-2FD超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司;Ti2荧光倒置显微镜购自佰泰科技有限公司;Happy-TL21台式高速冷冻离心机购自长沙东旺实验仪器有限公司;TW23L电子天平购自岛津企业管理(中国)有限公司;L125紫外辐射仪购自深圳市林上科技有限公司;1510酶标仪、TSQ8000evo气相色谱质谱联用仪购自赛默飞世尔仪器有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 树莓果油的提取 去除树莓冷冻果中的杂质后于电热恒温鼓风干燥箱中烘干(温度55 ℃)。超微粉碎机粉碎树莓干果(转速22 000 r/min,时间1～2 s)后用80目筛网(孔径0.2 mm)分离籽和果粉。将树莓果粉在超临界CO2萃取设备上按预先设定的萃取条件进行油脂萃取。萃取温度50 ℃,CO2流速3.5 L/min,萃取压力400 bar,萃取时间30 min。

1.4.2 树莓果油GC-MS分析 色谱条件:TG-5SILMS石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm);载气:甲烷;流速1.0 mL/min;不分流,进样1 μL;进样温度280 ℃;升温程序:60 ℃,保持1 min,以10 ℃/min的速率升温至180 ℃,以4 ℃/min的速率升温至280 ℃,保持20 min,再以20 ℃/min的速率升温至300 ℃,保持2 min。质谱条件:EI离子源;离子源温度:250 ℃;扫描质量范围m/z 40～550;图谱检索:NIST质谱库,采用Thermo Xcalibur3.1软件分析数据,峰面积归一法确定各化学成分的相对含量。

1.4.3 HaCaT细胞培养 采用含15% FBS的HaCaT细胞专用培养基于37 ℃、5% CO2的三气培养箱中培养HaCaT细胞。定期更换培养液,待细胞融合度至80%以上,以1×104个/孔的浓度接种于96孔板中。

1.4.4 树莓果油对HaCaT细胞存活率的影响 待96孔板中的HaCaT细胞融合至60%左右时,弃除96孔板中原有的HaCaT细胞专用培养基,加入用无血清MEM培养基配制的树莓果油(15.6、31.3、62.5、125、250、500、1000 μg/mL,以0.5% DMSO为溶剂)和0.5% DMSO孵育,每个剂量设置6个复孔。4 h后将树莓果油和0.5% DMSO更换为无血清MEM培养基继续培养24 h。测定细胞存活率时每孔加入10 μL CCK-8,在三气培养箱中孵育1 h,于450 nm处测定吸光值。

1.4.5 HaCaT细胞UVB光老化模型的建立 待96孔板中的HaCaT细胞融合至60%左右时,将原有的HaCaT细胞专用培养基更换为无血清MEM培养基培养4 h。UVB照射前用适量PBS替换MEM培养基,UVB照射剂量为0、30、60、90、120和150 mJ/cm2,每个剂量设置6个复孔。照射结束后将PBS更换为无血清MEM培养基于37 ℃、5% CO2的三气培养箱中继续培养24 h,细胞存活率测定操作同1.4.4。选择细胞存活率为未经UVB照射细胞50%左右的UVB照射剂量进行后续实验。

1.4.6 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞形态和存活率的影响 实验分为空白组、模型组和树莓果油处理组,每组设6个复孔。空白组HaCaT细胞既不进行UVB辐射处理,也不加入树莓果油;模型组细胞只进行UVB照射,不加入树莓果油;树莓果油处理组用不同浓度的树莓果油孵育4 h后再进行UVB照射;UVB照射操作同1.4.5。UVB辐射结束后,空白组将HaCaT细胞专用培养基更换为无血清MEM培养基,模型组和树莓果油处理组将PBS更换为无血清MEM培养基,细胞存活率测定同1.4.4。

1.4.7 HaCaT细胞外基质成分和基质金属蛋白酶含量测定 收集空白组、模型组、树莓果油处理组HaCaT细胞上清液,按照ELISA检测试剂盒操作说明书测定COL1A1和MMP-3含量,于450 nm处测定吸光值。

1.4.8 HaCaT细胞中炎症因子含量测定 按ELISA检测试剂盒操作说明书分别测定空白组、模型组、树莓果油处理各组HaCaT细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,于450 nm处测定吸光值。

1.4.9 HaCaT细胞中抗氧化因子含量测定 弃去空白组、模型组、树莓果油处理组HaCaT细胞上清液,加入适量预冷的PBS润洗后每孔加入100 μL RIPA细胞裂解液,冰上孵育30 min,离心收集HaCaT细胞裂解液。按照ELISA检测试剂盒说明书操作,测定Trx的含量,于450 nm处测定吸光值;用试剂盒(微板法)测定SOD的含量,在405 nm处测定吸光值。采用BCA试剂盒测定各孔蛋白浓度,于562 nm处测定吸光值。

1.5 数据处理

2 结果与分析

2.1 GC-MS结果分析

通过质谱库检索,从树莓果油中共鉴定出53种化学成分,主要为烷烃类、酯类、脂肪酸类和维生素。其中脂肪酸主要有棕榈酸(1.21%)、油酸(0.34%)和亚油酸(0.73%);脂肪酸酯有Z-9-油酸乙酯(0.34%);生育酚包括⊇-生育酚(0.88%)、ç-生育酚(1.04%)和维生素E(0.19%);α-谷甾醇为0.86%(图1)。

图1 树莓果油GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion-flow chromatogram of raspberry pulp oil

2.2 不同浓度树莓果油和0.5% DMSO对HaCaT细胞存活率的影响

如图2所示,与空白组相比,经15.6～1000.0 μg/mL树莓果油以及0.5% DMSO处理后的HaCaT细胞存活率无显著差异。说明0.5% DMSO和15.6～1000 μg/mL浓度范围的树莓果油对HaCaT细胞存活率无明显影响。因此,可继续使用0.5% DMSO来溶解树莓果油,并以浓度为15.6、31.3、62.5、125 和250 μg/mL的树莓果油进行后续实验。

图2 不同浓度树莓果油和0.5% DMSO对HaCaT细胞存活率的影响Fig.2 The effect of different concentrations of raspberry pulp oil and 0.5% DMSO on the cell viability of HaCaT cells

2.3 不同UVB辐射剂量对HaCaT细胞形态和存活率的影响

未经UVB照射(0 mJ/cm2)的HaCaT细胞性状规则、形态饱满、边缘清晰(图3-A)。经不同剂量UVB照射后的HaCaT细胞形态出现较为明显的改变,且随着UVB照射剂量增大细胞形态改变程度加剧,很多细胞出现轮廓不清晰、皱缩变圆、间隙增大、甚至破裂并产生碎片。UVB对HaCaT细胞存活率有极大影响(图3-B),与未经UVB照射的空白组相比,各UVB照射组的细胞存活率极显著降低(P<0.01),且呈现出明显的剂量依赖性。30 mJ/cm2UVB照射后细胞存活率约为空白组细胞的80%,120和150 mJ/cm2UVB照射组的细胞存活率不足40%,经60和90 mJ/cm2的UVB处理后细胞存活率为正常细胞的50%左右。为保证后续实验的顺利进行,兼顾实验效率,选择60 mJ/cm2作为UVB照射剂量进行后续实验。

2.4 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞形态和存活率的影响

由图4可知,对HaCaT细胞进行60 mJ/cm2UVB辐射后,细胞形态明显改变,出现细胞形状不规则和破裂溶解现象,细胞存活率较空白组极显著降低(P<0.01),仅为正常细胞的50%左右;经树莓果油处理后,受损的细胞有明显的恢复与改善,正常形态的细胞随树莓果油浓度的升高逐渐增多,且细胞存活率与模型组相比极显著升高并呈出明显的剂量依赖性。说明浓度为15.6～250 μg/mL的树莓果油对UVB诱导的HaCaT细胞光老化具有显著的抑制作用。

A.不同UVB照射剂量对HaCaT细胞形态的影响(×100);B.不同UVB照射剂量对HaCaT细胞存活率的影响;##同空白组相比P<0.01。A.The effect of different UVB irradiation doses on the morphology of HaCaT cells (×100);B.The effect of different UVB irradiation doses on the cell viability of HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01).图3 不同UVB照射剂量对HaCaT细胞形态和存活率的影响Fig.3 The effect of different UVB irradiation doses on the morphology and cell viability of HaCaT cells

A.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞形态的影响(×100);B.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞存活率的影响;##同空白组相比P<0.01;**同模型组相比P<0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on morphology of UVB-induced photoaging HaCaT cells (×100);B.The effect of raspberry pulp oil on cell viability of UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).图4 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞形态和存活率的影响Fig.4 The effect of raspberry pulp oil on morphology and cell viability of UVB-induced photoaging HaCaT cells

2.5 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞外基质成分和基质金属蛋白酶含量的影响

对HaCaT细胞中COL1A1含量的测定结果表明,经UVB辐照损伤建模处理的HaCaT细胞与空白组相比,其含量极显著降低(P<0.01),经树莓果油处理后,15.6、62.5、125 μg/mL的树莓果油能极显著升高光老化HaCaT细胞中COL1A1含量,31.3 μg/mL的树莓果油能显著升高COL1A1含量(P<0.05,图5-A);由图5-B显示,与空白组相比,模型组HaCaT细胞中MMP-3含量极显著升高(P<0.01),与模型组相比,树莓果油浓度为15.6 μg/mL时,光老化HaCaT细胞中MMP-3含量显著降低(P<0.05)。根据以上结果推测,树莓果油能够升高光老化HaCaT细胞中COL1A1含量,降低MMP-3含量,进而改善光老化皮肤的弹性。

2.6 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中炎症因子含量的影响

由图6-A可知,经60 mJ/cm2的UVB辐射后,HaCaT细胞中IL-1β含量与空白组相比极显著升高(P<0.01),而预先添加树莓果油时,HaCaT细胞中UVB照射引起的IL-1β含量升高受到抑制,与模型组比,树莓果油浓度为62.5 和125 μg/mL时,光老化HaCaT细胞中IL-1β含量极显著降低(P<0.01);由图6-B可知,经UVB照射后HaCaT细胞中IL-6含量与空白组相比极显著升高(P<0.01)。不同浓度树莓果油处理后,相比模型组,树莓果油浓度为125和250 μg/mL时,光老化HaCaT细胞中IL-6含量极显著降低(P<0.01),树莓果油浓度为31.3和62.5 μg/mL时,IL-6含量显著降低(P<0.05);由图6-C可知,与空白组相比,60 mJ/cm2的UVB辐射后HaCaT细胞中TNF-α含量极显著升高(P<0.01),而经15.6～250 μg/mL树莓果油预先处理后,可以看出HaCaT细胞中TNF-α含量与模型组相比极显著降低。结果表明,树莓果油可降低IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,从而减少光老化HaCaT细胞中炎症反应的程度。

A.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中COL1A1含量的影响;B.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中MMP-3含量的影响;##同空白组相比P<0.01;*同模型组相比P<0.05;**同模型组相比P<0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on the content of COL1A1 in UVB-induced photoaging HaCaT cells;B.The effect of raspberry pulp oil on the content of MMP-3 in UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01);*means significant difference compared with the model group(P<0.05);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).图5 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞外基质成分和基质金属蛋白酶含量的影响Fig.5 The effect of raspberry pulp oil on the content of extracellular matrix component and matrix metalloproteinase in UVB-induced photoaging HaCaT cells

2.7 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中抗氧化因子含量的影响

由图7-A可知,模型组HaCaT细胞中Trx含量相比空白组极显著降低(P<0.01),当用不同浓度树莓果油处理之后发现,树莓果油浓度为62.5和125 μg/mL时,光老化HaCaT细胞中Trx含量与模型组相比极显著升高(P<0.01),树莓果油浓度为250 μg/mL时Trx含量显著升高(P<0.05);由图7-B可知,与空白组比较,经60 mJ/cm2UVB辐射的HaCaT细胞中SOD含量极显著降低(P<0.01),采用不同浓度树莓果油处理后光老化HaCaT细胞中SOD含量相比模型组极显著升高(P<0.01)且呈剂量依赖关系。可见,树莓果油能有效增加UVB诱导的光老化HaCaT细胞中抗氧化因子Trx、SOD含量来提高光老化HaCaT细胞的抗氧化水平。

A.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中IL-1β含量的影响;B.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中IL-6含量的影响;C.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中TNF-α含量的影响;##同空白组相比P <0.01;*同模型组相比P <0.05;**同模型组相比P <0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on the content of IL-1β in UVB-induced photoaging HaCaT cells;B.The effect of raspberry pulp oil on the content of IL-6 in UVB-induced photoaging HaCaT cells;C.The effect of raspberry pulp oil on the content of TNF-α in UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means significant difference compared with the blank group (P <0.01),*means significant difference compared with the model group(P<0.05);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).图6 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中炎症因子含量的影响Fig.6 The effect of raspberry pulp oil on the content of inflammatory factors in UVB-induced photoaging HaCaT cells

A.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中Trx含量的影响;B.树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中SOD含量的影响;##同空白组相比P<0.01;*同模型组相比P<0.05;**同模型组相比P<0.01。A.The effect of raspberry pulp oil on the content of Trx in UVB-induced photoaging HaCaT cells;B.The effect of raspberry pulp oil on the content of SOD in UVB-induced photoaging HaCaT cells;##means extremely significant difference compared with the blank group (P<0.01);*means significant difference compared with the model group(P<0.05);**means extremely significant difference compared with the model group (P<0.01).图7 树莓果油对UVB诱导的光老化HaCaT细胞中抗氧化因子含量的影响Fig.7 The effect of raspberry pulp oil on the content of antioxidant factors in UVB-induced photoaging HaCaT cells

3 讨 论

植物油脂中的重要活性成分主要有脂肪酸、维生素和甾醇等[21],它们在对抗皮肤光老化中具有举足轻重的作用。研究表明,不饱和脂肪酸在皮肤生理中扮演着重要的角色。油酸是一种单不饱和脂肪酸,具有滋养皮肤、吸收UVB的功能,是制作天然防晒剂的优质原料[22];另一种不饱和脂肪酸亚油酸,可通过降低炎症反应来预防和降低紫外线导致的皮肤红斑损伤[23];Z-9-油酸乙酯是一种不饱和脂肪酸乙酯,它能升高HaCaT细胞存活率,并对UVB辐射具有显著的抵抗作用,在天然抗紫外领域有潜在的应用价值[24]。维生素E是人体最主要的亲脂非酶类抗氧化剂,它可以上调机体的抗氧化水平并抑制蛋白激酶C的活性,进而减少胶原酶的表达,抑制胶原降解,预防皮肤的光老化[25]。此外,谷甾醇对皮肤有很高的渗透性,其乳剂在一定浓度范围内能降低脂蛋白,增强脂肪酶活性,具有减少皮肤红斑形成、缓解炎症发生,防止皮肤衰老等功效,在化妆品中常作为皮肤营养剂使用[26]。GC-MS分析显示,树莓果油中油酸、亚油酸、Z-9-油酸乙酯、维生素E和α-谷甾醇的含量分别为0.83%、0.73%、0.34%、0.19%和0.86%,为其抑制UVB诱导的HaCaT细胞光老化提供了重要的物质基础。

COL1A1是人体细胞外基质中含量最丰富的蛋白质,占正常人皮肤中胶原的70%以上。它除了在皮肤组织结构中起到支撑作用和维持皮肤弹性外,还能够调节细胞的增殖、迁移以及特定基因的表达[27]。MMPs是细胞中的一种能降解细胞外基质的酶,正常细胞中含量极少。研究发现,UVB可激活细胞转导途径,引起细胞内MMPs含量增多,减少胶原的产生并加速胶原的溶解,使胶原纤维变细、变直,数量减少,从而使角质形成细胞聚集异常变性的胶原蛋白,导致皮肤无法维持正常的弹性发生光老化[28-30]。因此,减少MMPs的生成可以增加胶原蛋白的合成,紧致皮肤,对抗UVB辐射。本研究中,树莓果油能显著降低光老化HaCaT细胞中MMP-3含量,提高COL1A1含量,表明树莓果油能通过减少MMP-3的生成缓解胶原蛋白的降解,对维持光老化皮肤的弹性具有一定作用。鲁晶晶等[31]研究发现桦褐孔菌提取物可促进UVB诱导的光老化HaCaT细胞中COL1A1的产生,抑制MMP-3的表达。Han等[32]研究发现,粗齿绣球可下调经UVB照射的HR-1无毛小鼠皮肤组织中MMP-3的表达并上调COL1A1的表达。这些研究结果[31-32]与本研究类似。

UVB辐射可诱导角质形成细胞产生IL-1β、IL-6和TNF-α等多种炎性因子[33-34]。TNF-α是最早产生的促炎介质,主要由活化的单核巨噬细胞产生,它在炎症反应的发生过程中具有关键作用[35],TNF-α能激活中性粒细胞和淋巴细胞,增加血管内皮细胞的通透性,促进其他细胞炎性因子的合成和释放[36]。IL-1β在角质形成细胞中刺激表皮生长因子受体,导致MMPs表达水平增加,促进胶原蛋白的降解,从而加快皮肤光老化[37]。IL-6则通过自分泌诱导MMPs的表达,导致细胞外基质的降解,进而诱导皮肤光老化[38]。本研究发现,树莓果油能显著降低UVB光损伤HaCaT细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量,表明树莓果油能有效减少光老化HaCaT细胞中炎性因子的分泌,减轻皮肤炎症反应的发生。同时,由于IL-1β和IL-6对MMPs表达水平的影响,因此树莓果油降低表皮细胞炎症反应的结论与其减少MMP-3的结论相互印证。Li等[39]以UVB诱导的昆明小鼠为光老化模型,发现陈皮油可减少光老化昆明小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。苏牧楠等[40]证明纳豆提取物可显著抑制UVB照射后HaCaT细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。本研究结果与上述研究证实的天然植物成分在体内与体外均可通过减轻炎症反应发挥其抗光老化作用一致。

Trx是非酶类抗氧化剂,以硫醇氧化还原作用调节酶和转录因子[41]。其通过调节细胞氧化还原水平并清除过多的活性氧减轻UVB诱导的炎症反应[42]。SOD作为皮肤中内源性的抗氧化系统,是自由基的天然清除剂,也是人体内是唯一以自由基为底物进行歧化反应的酶,具有抑制氧化应激、减缓炎症的功能[34]。本研究为探究树莓果油对光老化HaCaT细胞抗氧化方面的作用,对HaCaT细胞中Trx和SOD含量进行了测定。结果表明,经树莓果油处理后,UVB光老化HaCaT细胞中Trx和SOD的含量均明显升高,说明树莓果油能够显著提高UVB诱导的光老化HaCaT的抗氧化能力,有效对抗UVB对HaCaT细胞造成的氧化损伤,维持细胞内氧化还原平衡。Agnieszka等[15]证实沙棘籽油可通过增加Trx和SOD水平进而提高经UVB辐射后的光老化HaCaT细胞的氧化稳定性。陈海英[43]研究了扇贝多肽对UVB诱导的小鼠胸腺淋巴细胞中Trx表达水平的影响,发现扇贝多肽可明显提高光老化小鼠胸腺淋巴细胞中Trx的表达。谢璟等[44]研究发现杨梅黄酮可显著升高UVB诱导的光老化昆明小鼠皮肤组织中SOD的含量。本研究结果与上述研究结果基本相同。

4 结 论

本研究初步证实了树莓果油对UVB诱导HaCaT细胞的光老化具有明显的抑制作用,可能通过以下途径实现:①升高UVB光老化HaCaT细胞中COL1A1的含量,降低MMP-3的含量来减少细胞外基质降解;②降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量减轻炎症反应;③升高抗氧化因子Trx和SOD含量缓解细胞氧化应激。树莓果油中所含有的油酸、亚油酸、Z-9-油酸乙酯、维生素E和谷甾醇为其抗UVB诱导的光老化提供良好的物质基础。本研究为树莓果油在细胞光老化防治领域的应用提供了新的实验依据,对树莓果油的进一步开发和利用具有重要价值。然而,树莓果油抑制UVB诱导光老化的作用机制还有待进一步深入研究。