基于HPLC指纹图谱结合化学计量学的落花生枝叶药材质量评价研究

李新晔 ，孔富康 ，张彤 ，浦益琼，

1.上海中医药大学中药学院，上海 201203； 2.上海中医药大学教学实验中心，上海 201203

落花生枝叶为豆科植物落花生Arachis hypogaeaL.的干燥地上部分，在我国多数地区均有种植，资源丰富[1]。该药具有清热解毒、宁神降压功效，研究表明其有镇静催眠、降血压、止血、增强机体免疫功能、调节血糖、抗氧化等药理作用[2-5]，主治跌打损伤、痈肿疮毒、失眠、高血压，临床用于落花安神合剂、欣梦安神颗粒和花丹安神合剂等复方制剂中治疗失眠[6-8]，疗效显著且无明显不良反应、毒性或依赖性。落花生枝叶成分复杂，主要包括萜、黄酮、苷、甾醇、酚酸和脂肪酸等类化学成分[9-14]。文献表明，在对氯苯丙氨酸小鼠失眠模型中，阿魏酸可显著延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间、缩短睡眠潜伏期、提高睡眠率[15]，酚酸类成分具有镇静、镇痛作用，是改善睡眠的主要活性成分[16-17]。

目前该中药品种尚未被《中华人民共和国药典》收录，仅在1993年版《河南省中药材标准》[18]、2009年版《湖南省中药材标准》[19]、2018年版《宁夏中药材标准》[20]等地方标准有记载，且上述标准中均无含量测定项目规定，使落花生枝叶的质量控制较困难。指纹图谱结合模式识别方法能真实、形象地反映中药质量差异，揭示复杂化合物之间的规律，已被逐渐应用于药物的质量控制、差异标志物的筛选等中药质量研究中，为相关中药的质量标准提升提供了有效策略[21-23]。因此，本研究收集多产地的落花生枝叶药材，建立HPLC指纹图谱，有效分离色谱峰，指认其化学成分，同时结合化学计量学对数据进行深入分析，筛选出引起产地差异的标志性成分，以期为落花生枝叶药材资源的开发利用及质量控制标准的制定提供依据。

1 仪器与试药

对照品单咖啡酰酒石酸（批号JOT-10951，含量以98.59%计），成都普菲德生物技术有限公司；原儿茶酸（批号ST04100120，含量以98%计）、菊苣酸（批号ST01970120，含量以98%计），上海诗丹德标准技术服务公司；对香豆酸（批号112037-201801，含量以99.3%计）、咖啡酸（批号110885-201703，含量以99.7%计）、阿魏酸（批号110773-201915，含量以99.4%计），中国食品药品检定研究院；HPLC级甲醇，德国Merck公司；其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；纯净水，自制。27批落花生枝叶药材均为自采，经上海中医药大学中药学院张红梅博士鉴定为豆科植物落花生Arachis hypogaeaL.的干燥地上部分。样品来源信息见表1。

表1 27批落花生枝叶样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用ZORBAX Eclipse XBD-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.5%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30 min，8%→15%A；30～36 min，15%A；36～83 min，15A%→29%A；83～105 min，29%A），检测波长0～16 min为260 nm、16～120 min为310 nm，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL。

2.2 混合对照品溶液制备

分别精密称取原儿茶酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸和菊苣酸对照品适量于5 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶解并稀释至刻度，制得各对照品母液；再精密吸取6种对照品母液适量，加50%甲醇水稀释，制得原儿茶酸为30.31 μg/mL、单咖啡酰酒石酸为121.76 μg/mL、咖啡酸为35.43 μg/mL、对香豆酸为6.91 μg/mL、阿魏酸为6.72 μg/mL、菊苣酸为80.18 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取落花生枝叶粉末（过4号筛）约 1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液10 mL，称定质量，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇水补足减失质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取同一批药材（S4）粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录指纹图谱。以单咖啡酰酒石酸的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间RSD为0.02%～0.16%，相对峰面积RSD为0.17%～2.63%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

雪萤焦急地说：“别听他的，他这种人什么事做不出来？！”一杭说：“听到了吗？如果你的话可信，看守公厕的老人能被杀？夏冰能被送进监狱？我能落到今天这个地步？”

取同一批药材（S4）粉末，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样6次，测定指纹图谱。以单咖啡酰酒石酸的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间RSD为0.11%～0.20%，相对峰面积RSD为0.84%～1.87%，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取一批药材（S4）粉末，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h测定指纹图谱，以单咖啡酰酒石酸的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含12个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。各共有峰相对保留时间RSD为0.05%～0.26%，相对峰面积RSD为0.25%～2.23%，表明样品24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立与评价

2.5.1 指纹图谱建立及共有峰标定

分别取27批不同产地的落花生枝叶药材1.0 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将27批落花生枝叶药材指纹图谱依次导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件，设定S1为参照图谱，采用平均数法，时间窗宽度为0.1，进行多点校正和色谱峰匹配，得到落花生枝叶药材指纹图谱叠加图（见图1），并生成落花生枝叶药材的对照指纹图谱（见图2）。

图2 落花生枝叶药材对照指纹图谱

查阅相关文献报道[12，24-25]，并与对照品的保留时间进行比对，确定峰2为原儿茶酸，峰4为单咖啡酰酒石酸，峰6为咖啡酸，峰8为对香豆酸，峰9为阿魏酸，峰11为菊苣酸。由于单咖啡酰酒石酸色谱峰面积最大、分离度较好，因此选择单咖啡酰酒石酸色谱峰为参照峰，标定出12个共有指纹峰。

2.5.2 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）软件进行评价，计算27批落花生枝叶药材指纹图谱的相似度，结果见表2。共有峰峰面积占77.42%，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，共有峰的相对保留时间较稳定（RSD为0.06%～0.20%），但共有峰的相对峰面积差异较大 （RSD为23.09%～120.11%）。不同批次落花生枝叶与对照指纹图谱比较，除河北邢台、河北唐山和河南南阳三产地样品外，相似度均大于0.9，提示不同产地之间落花生枝叶整体化学组分类似，药材质量稳定，但部分地区样本存在一定差异。

表2 27批落花生枝叶药材相似度

2.6 化学模式识别研究

2.6.1 聚类分析

使用SPSS20.0软件，以12个共有峰峰面积为变量，采用Z得分法进行数据标准化处理，以组间联接法进行系统聚类分析（HCA），结果见图3。可以看出，河南南阳（Ⅰa）、江苏泰州（Ⅰb）、河北唐山（Ⅰc）、上海（Ⅰd）、河北邢台（Ⅰe）、辽宁营口（Ⅰf）、广西玉林（Ⅱa）、广东湛江、韶关（Ⅱb）落花生枝叶样品分别各自聚成一小类，江西赣州、湖南长沙和福建福州、泉州的落花生枝叶样品聚成一小类（Ⅰg）。分类结果明显与药材产地密切相关，27批落花生枝叶药材被聚成两大类（Ⅰ和Ⅱ组），广西玉林和广东湛江、韶关产地距离较近被分成一大类，并和其他产地差距明显较大。

图3 27批落花生枝叶药材HCA树状图

2.6.2 主成分分析

为进一步分析27批落花生枝叶间的差异，将27批落花生枝叶药材作为研究对象，把共有峰的峰面积作为变量导入SIMCA14.1统计软件进行无监督模式的主成分分析（PCA）建模，前3个主成分累积贡献率R2X达90.5%，Q2为0.856，说明模型有效，结果见图4。结果显示，右侧广西玉林和广东湛江、韶关的落花生枝叶（S10～S12、S22～S23）明显与其他产地差异较大，与聚类分析结果相符，表明不同产地落花生枝叶药材化学成分存在较大差异。

图4 落花生枝叶药材PCA得分图

2.6.3 正交偏最小二乘-判别分析

为更好分析广东、广西与其他产地落花生枝叶药材的差异性，以12个共有指纹峰的峰面积为变量，导入SIMCA14.1软件，将不同产地落花生枝叶药材分成两组，建立有监督模式识别的正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）模型进行分析，得到27批OPLS-DA得分图，该OPLS-DA模型的R2X=0.903，R2Y=0.958，Q2=0.94，表明该模型具有较好的解释能力和预测能力。为防止该模型过拟合造成假阳性结果，设置分类Y矩阵变量随机排列200次做置换检验，得置换检验图（见图5），R2回归线在Y轴截距为0.076 8、Q2回归线在Y轴截距为-0.384，表明所建立的模型没有出现过拟合现象，可用于判别分析27批样品的组间差异。

图5 OPLS-DA模型置换检验

载荷图可以根据变量离原点的距离判断变量对主成分的影响权重，距离原点越远的变量对主成分的影响权重越大。分析各变量对主成分1的影响权重，最大为峰11，其次为峰4，见图6。根据变量重要性投影（VIP），以VIP>1.0为显著影响，共找出不同产地落花生枝叶药材2个差异性标志物，分别为峰11和峰4，且峰11>峰4，提示可能因为峰4（单咖啡酰酒石酸）和峰11（菊苣酸）面积相对较大，对其结果影响较为明显，见图7。

图6 落花生枝叶药材色谱峰变量载荷图

图7 27批落花生枝叶药材各成分VIP

3 讨论

本试验通过二极管阵列检测器（DAD）进行全波长扫描，在波长310 nm处可以较全面地反映酚酸类成分，色谱峰信息全面，各峰吸收均匀，整体峰形良好，考虑到原儿茶酸最大吸收波长为260 nm且峰面积较小，为较全面反映峰面积信息，所以在前16 min波长为260 nm，同时比较了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸水溶液、甲醇-0.5%甲酸水溶液等流动相系统梯度洗脱情况，发现甲醇-0.5%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时色谱峰分离度较好、对称性最好，杂质干扰较小，确定流动相通过最终优化建立较全面的落花生枝叶药材HPLC指纹图谱。

本试验前期考察回流法、超声提取法的提取效果，结果2种提取方式峰个数差异不大，超声相对回流更方便省时，所以最终选择超声作为提取方式。同时对提取溶剂30%、50%、70%甲醇水和甲醇进行综合考察，发现以50%甲醇水为提取溶剂、液料比为1∶50时，提取效果最佳，色谱峰基线较为平稳、杂质干扰较少，因此选择50%甲醇水为提取溶剂。

对11个产地27批落花生枝叶药材建立指纹图谱，共确定12个共有峰，共有峰峰面积占比77.42%，能较好代表落花生枝叶整体质量；通过对照品比对，指认出原儿茶酸、单咖啡酰酒石酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、菊苣酸6个成分。

采用不同分析方法对落花生枝叶药材12个共有峰进行多元统计分析，考察样品整体性与差异性。结果27批样品相似度在0.846～0.985，表明27批药材整体化学组分类似，药材质量稳定，但可能由于受到气候降水量[26]、土壤[27]、地势地貌等环境因素影响，花生品种[28]、种植方式[29]及采收加工过程中人为因素的影响，导致药材内在化学成分的含量存在一定差异。

为更好辨识药材之间的质量差异，采用HCA和PCA，将27批落花生枝叶样品分成两大类，结果显示，广西（玉林）和广东（湛江、韶关）两省与其他地区差异明显。相关文献调查表明，我国南方7个花生主产区（广东、广西、江西、福建、云南、湖南和海南）属于南方春秋花生产区，广西、广东两地气温较高，气候具有光照充足、雨量充沛、无霜期长等特点，使该地花生产业的温、光、水、气条件较其他花生产区具有一定优势[30]。此外，通过OPLS-DA筛选出2个差异性质量标志物，分别是4号峰（单咖啡酰酒石酸）和11号峰（菊苣酸），可作为鉴别和区分落花生枝叶饮片质量的指标。

本研究采用HPLC建立不同批次落花生枝叶指纹图谱，结合HCA、PCA和OPLS-DA方法，有效评价不同批次落花生枝叶的整体质量，并快速筛选出不同批次落花生枝叶差异性质量标志物，可为落花生枝叶药材的质量控制提供方法学与试验依据。