外泌体微RNA治疗骨关节炎研究进展

陆智豪，陈立民，王颖赞，曾 平

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院仙葫院区骨病创伤骨科，广西 南宁 530023)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性退行性关节病，其病理特征为进行性关节软骨降解、滑膜炎症和软骨下骨硬化[1]。据估计，全球60岁以上的人口中，10.0%的男性和13.0%的女性罹患有症状的OA[2]。由于人口老龄化和社会工业化的进程，OA的患病率进一步增加，给社会带来沉重的经济和医疗负担[3]。目前，临床上对早期OA的治疗多以缓解症状为主，主要应用非甾体类药物，但存在一定的不良反应[4]。对于晚期OA患者则多采取手术治疗，如关节置换术等，但手术治疗要求手术医师有较高的技术水平，患者需要承担手术的风险和昂贵的费用，且不能对退变的关节及软骨起修复作用。因此，寻求一种促进软骨再生修复和可逆转早期OA关节结构病变的关节内治疗方法是近来的研究热点。目前，较为常用的关节内治疗方法是关节内注射骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)[5]。然而，BMSCs疗法存在注射部位寿命较短、异体移植的免疫激活、栓塞形成及不必要的或恶性转化的可能，这给BMSCs疗法带来困难。外泌体是一种直径为40～100 nm的脂质双分子层膜衍生囊泡，几乎所有细胞都能分泌外泌体，且在体液中广泛分布[6]，能以自分泌和旁分泌途径参加细胞间通讯。近来发现，外泌体中包含各种核酸，其中外泌体所包含的微RNA(microRNA，miRNA)通过与靶mRNA的非编码区结合，介导转录后的基因沉默，从而调节多个生物化学途径[7]。由于外泌体独特的囊泡样结构，外泌体中的 miRNA能够稳定表达[8]。越来越多的研究表明，外泌体中的miRNA能有效地调控OA，其作用主要集中于对软骨、滑膜及软骨下骨的影响。因外泌体具有毒性小、安全性高、免疫原性低等优点，在OA的治疗中具有更好的临床治疗前景[9]。本文主要就外泌体miRNA对OA患者软骨、滑膜、软骨细胞外基质(extracellular matrix，ECM)及软骨下骨的影响进行综述，以期为临床和科研上应用外泌体miRNA治疗OA提供参考。

1 外泌体miRNA对软骨的影响

与大多数组织不同，软骨是无血管、淋巴和神经的结缔组织[10]，其再生潜力非常低，依靠软骨自身修复不足以恢复退化组织的结构和功能，因此，关节软骨的再生及重塑也成为骨科医生和研究人员亟需攻克的难题[11]。不同来源的细胞分泌的外泌体携带有不同特异性miRNA，对软骨细胞的凋亡、自噬、焦亡、增殖具有调控作用。

1.1 外泌体miRNA对软骨细胞凋亡的调控作用研究报道，外泌体miRNA可通过特异性调节软骨细胞凋亡信号通路关键分子的表达来促进或抑制软骨细胞凋亡[12]。正常的软骨细胞凋亡是机体维持健康状态的一种自然的程序性细胞死亡，因此，软骨细胞过度凋亡可加剧关节软骨的降解，促进OA的发展[13]。LIN等[14]研究证实，miR-140-5p富集于人牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSC)来源的外泌体，可在白细胞介素(interleukin，IL)-1β处理的人软骨细胞中促进软骨细胞凝聚糖、Ⅱ型胶原的α1链(type Ⅱ collagen α1，Col2α1)和SRY相关蛋白9(SRY-related high mobility group-box gene 9，Sox9)等相关mRNA的表达，显著减少OA大鼠软骨细胞凋亡。研究发现，姜黄素处理间充质干细胞后衍生的外泌体能够维持OA模型小鼠软骨细胞的活力，同时抑制软骨细胞的凋亡，其机制是姜黄素通过抑制间充质干细胞衍生的外泌体miR-143和miR-124中的启动子区域的甲基化，抑制其靶基因ROCK1和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的表达，进而抑制炎症因子激活，从而间接抑制软骨细胞凋亡[15-17]。研究报道，BMSCs衍生的外泌体能保护OA模型大鼠软骨损伤[18]。有研究发现，BMSCs衍生的外泌体中最显著富集的miRNA为miR-127-3p，其可抑制软骨细胞中的CDH11，阻断Wnt/β-连环蛋白通路的激活，继而减轻软骨细胞损伤，减缓软骨的降解[19]。

1.2 外泌体miRNA对软骨细胞焦亡的调控作用除了经典的细胞凋亡方式外，细胞自噬、焦亡分别通过不同的形式调节细胞死亡，在OA的发展和治疗中发挥作用。细胞焦亡是一种由炎症小体触发的促炎症性程序性细胞死亡，与其他形式的程序性细胞死亡不同，焦亡与炎症密切相关。研究表明，抑制软骨细胞焦亡可改善软骨变性和关节炎[20]。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)3可调节NF-κB基因活性[21]，而NF-κB基因的转录因子活性是激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体和焦变的关键因素。XU等[22]研究发现，miR-326过表达可显著抑制软骨细胞中HDAC3和NF-κB p65的表达，促进信号转导与转录激活因子 1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、乙酰化STAT1和乙酰化NF-κB p65在软骨细胞中的表达；双荧光素酶报告基因检测发现miR-326与HDAC3存在靶向关系；同时，发现BMSCs来源的外泌体可将miR-326输送到软骨细胞和软骨，并通过靶向HDAC3和STAT1/NF-κB p65抑制软骨细胞焦亡，从而改善OA。

1.3 外泌体miRNA对软骨细胞自噬的调控细胞自噬是在不致细胞死亡的情况下，通过分解功能紊乱的细胞器和大分子物质而使细胞得到翻新的一种稳态机制[23]。有研究表明，自噬在关节软骨组织中发挥着双重作用，细胞代谢加强和缺乏营养都会增加自噬，从而提高细胞的应激能力[24]，而自噬的过度激活可导致体外OA软骨细胞的死亡[25]。WU等[26]通过体内及体外研究证实，髌下脂肪垫来源于间充质干细胞的外泌体可将miR-100-5p传递至软骨细胞，而miR-100-5p特异性靶向哺乳动物雷帕霉素(mammalian target of rapamycin，mTOR)的非翻译区域，并显著增强软骨细胞中的自噬水平，增强合成代谢，抑制IL-1处理的OA软骨细胞的分解代谢。

1.4 外泌体miRNA对软骨细胞增殖的调控作用软骨细胞是一种多功能细胞，能够合成并分泌细胞外基质，起到修复损伤软骨的作用。SUN等[27]研究发现，miR-320c在已分化为软骨的人BMSCs来源外泌体中表达上调；来源于过表达miR-320c的人BMSCs来源外泌体可通过上调OA软骨细胞中的SOX9，促进软骨细胞的增殖分化。在软骨形成的早期阶段，Wnt信号能激活软骨细胞的增殖并抑制其分化[28]；Wnt家族成员5A(Wnt family member 5A，WNT5A)可激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，在OA的发病中对软骨的破坏和降解起着关键作用[29]。MAO等[30]研究报道，间充质干细胞来源外泌体miR-92a-3p直接靶向WNT5A，促进软骨细胞的增殖和迁移以及间充质干细胞向软骨细胞的分化，防止早期软骨损伤。有研究表明，滑膜来源间充质干细胞的外泌体miR-140-5p通过激活Yes相关蛋白可促进软骨细胞的增殖和迁移，且在前交叉韧带横断OA大鼠模型中起到抑制关节软骨严重损伤和OA进展的作用[31]。近年来，软骨生成祖细胞(chondrogenic progenitor cells，CPCs)已被证实在OA患者治疗中具有促进软骨修复、再生作用[32]。有研究发现，MRL/MpJ超治愈小鼠CPCs来源外泌体中miR-221-3p在MRL/MpJ小鼠来源CPCs外泌体中高度富集，而MRL/MpJ小鼠来源CPCs外泌体中的miR-221-3p能够通过与其相关通路诱导软骨细胞的增殖分化[33]。

2 外泌体miRNA对OA滑膜炎症的治疗作用

在OA患者中，滑膜的炎症性改变统称为滑膜炎，包括滑膜内膜增生、炎症细胞浸润、新血管生成和纤维化。约70%的OA患者出现滑膜炎，其程度与疼痛和软骨损伤相关[34]。急性滑膜炎被认为是最早发生的关节改变之一，而外泌体对滑膜炎症有一定的治疗作用[35]。JIN等[36]研究发现，BMSCs衍生的外泌体向滑膜成纤维细胞提供miR-26a-5p，并通过控制环加氧酶2的表达减轻OA滑膜成纤维细胞的损伤；此外，关节内注射过表达miR-26a-5p的BMSCs来源外泌体可通过减轻OA模型大鼠滑膜组织的炎症和减少细胞凋亡来防止OA损伤。JIN等[37]研究发现，关节内注射BMSCs来源外泌体miR-9-5p的OA大鼠的关节软骨组织呈连续、清晰的结构，且炎症细胞浸润较少，OA症状减轻，其作用机制是来自BMSCs的外泌体miR-9-5p通过靶向逆转原本在OA病变早期过表达的SDC1来抑制炎症并减轻软骨损伤。另有研究发现，miR-100-5p在来源于人类脱乳牙髓干细胞外泌体(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED-Exos)中富集，SHED-Exos中miR-100-5p通过直接靶向下游mTOR的3′未翻译区域，抑制软骨细胞中促炎症细胞因子IL-6、IL-8及MMP1、MMP3、MMP9、MMP13、人金属肽酶含血小板反应蛋白基元5等金属蛋白酶的表达，从而抑制颞下颌关节软骨细胞的炎症反应[38]。

来自OA软骨细胞的外泌体不仅可抑制滑膜炎症，还可起到促炎作用。这些外泌体通过miR-449a-5p抑制自噬相关基因4B的表达，从而抑制脂多糖诱导的巨噬细胞的自噬，促进线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mitoROS)的产生，从而进一步增强了炎症小体的激活，最终加重滑膜炎症，促进OA的进展，这为了解OA患者滑膜巨噬细胞和滑膜炎的激活提供了一个新的视角[39]。

3 外泌体miRNA对软骨ECM的调控作用

关节软骨ECM主要由蛋白多糖和Ⅱ型胶原组成，包括少量的软骨细胞。ECM含有大量信号分子，其在调控细胞的生长、分化、形态、迁移和代谢过程发挥积极作用，因此，当ECM分解与合成失衡将导致OA的发生[40]。研究表明，外泌体能抑制MMP13的表达，可有效促进OA大鼠软骨细胞ECM修复，缓解关节疼痛[18]。

HDAC作为软骨细胞成熟和骨骼生成的中心调节器，可抑制IL-1诱导的MMPs表达，调控软骨ECM的降解[41]。MAO等[42]研究发现，OA患者软骨分泌的外泌体中miR-95-5p表达显著低于正常软骨，而过表达的原代软骨细胞外泌体miR-95-5p通过直接靶向HDAC，抑制OA模型MMPs的表达，从而抑制软骨基质的降解。SUN等[27]研究证明，BMSCs来源外泌体和BMSCs来源外泌体中过表达的miR-320c都能上调SOX9和下调OA软骨细胞中MMP13的表达，抑制软骨细胞ECM降解，但过表达BMSCs来源外泌体中的miR-320c有更加显著的抑制作用。

4 外泌体miRNA促进OA软骨下骨重塑

软骨下骨皮质骨改建增加是骨关节炎早期主要病理改变之一。软骨下骨为浅层关节软骨提供结构支持和减震器，并在机械应力的作用下，经历着改造和重塑的动态平衡[43]。众多学者研究探讨了外泌体miRNA应用于OA的治疗前景，其中包括外泌体miRNA对OA软骨下骨重塑的调节作用[44]。ZHOU等[45]使用miRNA芯片对OA患者和健康人的滑膜外泌体中miRNA进行分析，发现来源于滑膜外泌体的miR-126-3p在OA患者的滑液样本中的表达较健康对照者显著下调；体内外研究发现，过表达滑膜来源外泌体miR-126-3p能维持OA大鼠模型的软骨下骨结构，甚至逆转OA动物模型中钙离子改变、关节空间形态和骨赘形成的改变，表明来源于滑膜外泌体的miR-126-3p对OA软骨下骨重塑有促进作用，能逆转OA病理改变。

许多退行性骨关节疾病早期症状不明显，出现症状时往往已经到中晚期，这无疑加大了疾病的诊治难度。研究证实，外泌体可作为多种疾病早期的生物标志物，有助于疾病的早期诊断[46]。miR-210-5p在OA硬化性软骨下骨成骨细胞(subchondral bone osteoblasts，SBOs)外泌体中富集,由于OA进展过程中软骨下骨的变化早于软骨，SBOs来源的外泌体miR-210-5p的异常上调可作为OA的标志物或预测因子。因此，抑制SBOs中miR-210-5p的表达可能是OA治疗的一个新方向[47]。

5 总结与展望

随着社会及人口老龄化趋势的发展，OA以其高发病率、高致残率引起医学界的重视；但其具体的机制尚未明确，这对OA早期的诊疗带来了难度。近年来，外泌体在临床治疗中的应用日益发展，并在OA治疗中显示出巨大的潜力，尤其是不同来源的外泌体miRNAs通过缓解甚至逆转OA的病理改变，如抑制软骨的降解和滑膜炎症及促进软骨下骨重塑，对OA起到显著的治疗作用。外泌体中所包含的不同的RNA和蛋白质成分，可作为OA早期症状不明显时的诊断生物标志物，亦可作为治疗OA的药物载体。然而，不同来源的外泌体miRNA在OA的生理病理中的关联仍需更多研究，以便开辟一个与OA治疗策略相关的创新研究领域。