腺苷预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白表达的影响

季 禾，栗延伟，谭 军，曹武璟，张振祥

(1.新乡医学院第三临床学院，河南 新乡 453003;2.新乡医学院第三附属医院神经内科，河南 新乡 453003;3.新乡医学院第三附属医院呼吸内科，河南 新乡 453003)

急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)是以突然起病、迅速出现神经功能障碍为特征的一类脑血管病，发病率较高。据统计，2010年至2019年，我国AIS的发病率从129/10万上升至145/10万[1]。AIS具有高致残率、高致死率的特点，患者即使得到及时治疗，也常因缺血、坏死等脑组织损伤而引起语言和肢体功能障碍。尽早开始再灌注治疗，挽救缺血半暗带以减轻脑缺血时脑损伤程度是AIS治疗的关键。国际指南广泛推荐的有效的再灌注治疗措施有急性期应用静脉溶栓及血管内介入治疗等措施[2-3]。但是，在恢复脑循环灌注时不可避免地会对脑组织结构产生进一步损害，影响大脑功能，即脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)，因此，寻找一种减轻CIRI的有效措施对于脑缺血性卒中的治疗极为重要[4-5]。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作为CIRI的重要机制可诱导细胞凋亡[6-7]。CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)是ERS的经典标志物，也是启动细胞凋亡的关键点[8]。腺苷是一种神经保护剂，有研究显示，腺苷激动剂可通过抑制ERS减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤[9]。刘超等[10]研究显示，腺苷激动剂可降低CHOP的表达，减轻大鼠心肌ERS，从而抑制细胞凋亡。基于此，本研究观察腺苷预处理(adenosine preconditioning，AP)对大鼠CIRI后CHOP表达和ERS的影响，探讨腺苷对CIRI的保护作用和机制，以期为预防AIS后CIRI提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物30只健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠由新乡医学院动物中心提供，体质量250～280 g。大鼠单笼饲养在鼠房内，给予自由饮水和充足的食物，并保持鼠房良好的通风、适宜的温度和湿度及明暗周期均衡的光线。

1.2 主要试剂与仪器大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型栓线购自北京西浓科技有限公司，水合氯醛购自上海源叶生物科技有限公司，腺苷购自美国 Sigma 公司，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染料、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)细胞凋亡荧光检测试剂盒以及蛋白酶K购自上海碧云天生物技术有限公司，CHOP抗体购自美国Signalway Antibody(SAB)有限公司，兔链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin peroxidase，SP)试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CHOP引物由广州如期生物技术有限公司设计并合成，mRNA 提取试剂(RNAiso Plus)、cDNA反转录试剂盒(PrimeScript RT Master Mix)购自北京宝日医生物技术北京有限公司，实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒(PowerUp SYBR Green Master Mix)购自赛默飞世尔科技有限公司；qRT-PCR仪购自美国Thermofisher公司，冷冻离心机购自德国HERMLE公司，全波长读数仪购自上海徕卡仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及预处理按随机数字表法将36只健康雄性SD大鼠分为假手术组、缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)组和AP组，每组12只。术前各组大鼠禁食12 h、禁水2 h。AP组大鼠腹腔注射腺苷注射液(1.5 mg·kg-1，生理盐水稀释至2 mL，术前3 d，每日1次)；假手术组和IR组大鼠在相同时间和地点腹腔注射2 mL生理盐水(术前 3 d，每日1次)。

1.3.2 大鼠MCAO及CIRI模型制备IR 组和 AP 组大鼠参考LONGA等[11]的方法制备MCAO模型：2组大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)麻醉，固定大鼠四肢于专用手术台并始终保持大鼠仰躺姿势状态，备皮、碘伏消毒颈部皮肤，铺洞巾，颈部正中偏左约0.5 cm处做纵向手术切口，钝性分离筋膜、肌肉及神经，结扎左侧颈外动脉及左侧颈总动脉，并在颈总动脉上剪一小口，轻轻插入MCAO栓线至颈内动脉，深度18～20 mm，缝合皮肤，碘伏消毒伤口，栓线固定于胸前皮肤。栓塞2 h后，向外拔栓线约1 cm制备CIRI模型。假手术组大鼠不插入栓线，余处理同IR组及AP组。

1.3.3 大鼠神经功能损伤评分3组大鼠苏醒后，按照5分制评分标准[12]对3组大鼠进行神经功能缺损评分，1～3分为有效模型；0、4分或死亡为无效模型，剔除术中因栓线插入过深致蛛网膜下腔出血的大鼠、麻醉药物个体差异等原因所致死亡的大鼠及无效MCAO模型大鼠，随时补充各组大鼠，以保证每组MCAO模型大鼠的数量一致；评分后单笼饲养于条件良好稳定的鼠房内，给予充足的食物和水。

1.3.4 组织取材和标本制备随机选取每组大鼠各6只，于再灌注24 h后腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)进行麻醉，麻醉成功后开胸经心脏快速灌注生理盐水200 mL后再灌注40 g·L-1多聚甲醛200 mL；将灌注后的大鼠快速断头取脑，冠状切取视交叉前后各 2 mm 脑组织，置于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定 24 h，脱水、透明、固定，石蜡包埋，使用切片机制备脑组织切片(厚度约5 μm)，用于HE染色、免疫组织化学染色及TUNEL染色。各组余下的6只大鼠于再灌注24 h后迅速断头取脑，新鲜脑组织保持于-80 ℃冰箱中，用于qRT-PCR检测。

1.3.5 HE染色观察脑组织形态石蜡切片于烤片机上65 ℃烤片2 h，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇(下行梯度100%、95%、85%、75%)脱二甲苯，流水冲洗，行苏木精染色，盐酸酒精分化、伊红染色，再经梯度乙醇(上行梯度75%、85%、95%、100%)脱水，二甲苯透明处理后中性树胶封片，显微镜下观察大鼠脑组织病理学变化。

1.3.6 qRT-PCR法检测脑组织中CHOP mRNA的表达取-80 ℃冰箱中冷存脑组织，应用TRIzol法提取总mRNA，应用全波长读数仪测波长260 nm和280 nm处的吸光度(absorbence,A)值，并选取A260/A280值在1.8～2.1之间的样本测定其浓度。按PrimeScript RT Master Mix cDNA反转录试剂盒说明书合成cDNA，反应条件：反转录反应37 ℃ 15 min，反转录酶失活反应 85 ℃ 5 s，4 ℃ 维持。按PowerUp SYBR Green Master Mix qRT-qPCR试剂盒说明书进行定量检测，以β-actin为参照。反应条件：UDG 酶激活 50 ℃ 2 min，预变性95 ℃ 2 min，95 ℃ 变性1 s，60 ℃ 退火/延伸30 s，共40个循环。CHOP mRNA上游引物序列为5′-TGTTGAAGATGAGCGGGTGG-3′，下游引物序列为5′-TGGACCGGTTTCTGCTTTCA-3′；β-actin上游引物序列为5′-TCAGCAAGCAGGAGTACGATG-3′，下游引物序列为5′-GTGTAAAACGCAGCTCAGTAACA-3′。检测荧光信号，获得相应 Ct 值，应用2-△△Ct法计算CHOP mRNA相对表达量。

1.3.7 SP法检测大鼠脑组织中CHOP蛋白表达取各组大鼠脑组织石蜡切片，经二甲苯脱蜡、下行梯度乙醇脱二甲苯、水洗及磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗、高压锅内抗原修复；滴加内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育20 min，滴加山羊血清室温封闭 30 min，再滴加CHOP一抗(滴度1100)，4 ℃冰箱过夜；然后，滴加生物素标记山羊抗兔 IgG 聚合物室温孵育 20 min，滴加辣根酶标记链霉标记卵白素工作液室温孵育 20 min；滴加二氨基联苯胺液染色，纤维镜下观察至细胞质出现黄色或棕黄色，自来水冲洗终止染色；苏木精复染 1 min，盐酸乙醇分化数秒后再经上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片。显微镜下观察，细胞质呈黄色或棕黄色者为 CHOP蛋白阳性表达。每张切片随机选取 5 个不重叠高倍视野(×400)采集图像，应用Image J 图像分析软件计算CHOP蛋白阳性细胞表达率。CHOP蛋白阳性细胞表达率=CHOP蛋白阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3.8 TUNEL法检测大鼠脑组织细胞凋亡的情况取各组大鼠脑组织石蜡切片，在烤片机上烤片30 min，温度设置在65 ℃；二甲苯脱蜡2次、梯度乙醇(下行梯度为100%、90%、70%)脱二甲苯3次，水洗后滴加Tris-HCl(pH=7.4)稀释的不含DNase的蛋白酶K，室温下孵育30 min，PBS洗涤3次，充分洗去蛋白酶K；然后，滴加TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS充分洗涤3次后用抗荧光淬灭封片液封片，避光下用荧光显微镜(×200)观察，每张切片选取3个不重叠高倍视野(×400)采集图像，应用Image J 图像分析软件计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%

2 结果

2.1 3组大鼠神经功能缺损评分比较假手术组、IR 组和AP组大鼠神经功能缺损评分分别为(0.000±0.000)、(2.889±0.272)、(1.167±0.408)分，3组大鼠神经功能缺损评分比较差异有统计学意义(F=157.923，P<0.05)；IR 组和AP组大鼠神经功能缺损评分显著高于假手术组，差异有统计学意义(t=17.663、7.133，P<0.05)；AP组大鼠神经功能缺损评分显著低于IR 组，差异有统计学意义(t=-10.530，P<0.05)。

2.2 3组大鼠脑组织病理学表现结果见图1。假手术组大鼠脑组织神经元形态结构正常，细胞核完整，间质无水肿；IR组大鼠脑组织神经元数目减少、细胞核溶解、出现空泡，间质水肿，组织疏松；AP组大鼠神经元损伤程度低于IR组。

A：假手术组；B：IR 组；C：AP组。

2.3 3组大鼠脑组织中CHOP mRNA相对表达量比较假手术组、IR 组和AP组大鼠脑组织中CHOP mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、3.850±0.091、1.881±0.067。3组大鼠脑组织中CHOP mRNA相对表达量比较差异有统计学意义(F=2 989.751，P<0.05)；IR组和AP组大鼠脑组织中CHOP mRNA相对表达量显著高于假手术组，差异有统计学意义(t=75.514、23.502，P<0.05)；AP组大鼠脑组织中CHOP mRNA相对表达量显著低于IR 组，差异有统计学意义(t=-52.171，P<0.05)。

2.4 3组大鼠脑组织中CHOP蛋白阳性细胞表达比较结果见图2。CHOP蛋白在细胞质中呈黄色或棕黄色。IR 组和AP组大鼠脑组织中CHOP 蛋白阳性细胞较假手术组显著增多，AP组大鼠脑组织中CHOP 蛋白阳性细胞显著少于IR 组。假手术组、IR 组和AP组大鼠脑组织中CHOP 蛋白阳性细胞表达率分别为(0.767±0.505)%、(21.650±3.442)%、(7.654±1.199)%。3组大鼠脑组织中CHOP 蛋白阳性细胞表达率比较差异有统计学意义(F=2 257.096，P<0.05)；IR组和AP组大鼠脑组织中CHOP 蛋白阳性细胞表达率显著高于假手术组，差异有统计学意义(t=65.927、21.744，P<0.05)；AP组大鼠脑组织中CHOP 蛋白阳性细胞表达率显著低于IR组，差异有统计学意义(t=-44.183，P<0.05)。

A：假手术组；B：IR 组；C：AP组。

2.5 3组大鼠脑组织细胞凋亡情况比较结果见图3。假手术组、IR 组和AP组大鼠脑组织细胞凋亡率分别为(0.063±0.137)%、(18.565±2.232)%、(9.104±2.030)%。3组大鼠脑组织细胞凋亡率比较差异有统计学意义(F=1 519.372，P<0.05)；IR组和AP组大鼠脑组织细胞凋亡率显著高于假手术组，差异有统计学意义(t=5.512、2.693，P<0.05)；AP组大鼠脑组织细胞凋亡率显著低于IR组，差异有统计学意义(t=-2.818，P<0.05)。

A：假手术组；B：IR 组；C：AP组。

3 讨论

1977年HEARSE[13]首次提出组织及器官在低灌注缺血后恢复血流灌注可进一步加重组织及器官的损伤。脑缺血再灌注期间可产生一系列复杂的生化代谢、生理功能、病理形态改变等，其机制复杂，包括炎症反应、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、能量代谢障碍、自由基损伤和细胞凋亡等多种机制。腺苷作为一种神经调节剂，其对CIRI的保护作用已被证实[14]。在脑组织缺血缺氧情况下，腺苷由低浓度生成和代谢平衡状态，快速调整为高浓度状态而发挥其神经保护作用。腺苷的主要神经保护机制有：抑制钙离子内流，减少兴奋性神经递质释放，阻止NO合成；抑制炎症细胞黏附和浸润，减轻炎症细胞介导的细胞损伤；抑制血小板的聚集，扩张脑血管；抑制自由基产生，减轻自由基介导的再灌注损伤；降低缺血后神经元的能量消耗，增加能量供应[15]。本研究结果显示，IR 组和AP组大鼠神经功能缺损评分明显高于假手术组，AP组大鼠神经功能缺损评分明显低于IR 组。假手术组大鼠脑组织神经元形态结构正常，细胞核完整，间质无水肿；IR组大鼠脑组织神经元数目减少、细胞核溶解、出现空泡，间质水肿，组织疏松；AP组大鼠神经元损伤程度较IR组显著减轻。IR组和AP组大鼠脑组织细胞凋亡率显著高于假手术组，AP组大鼠脑组织细胞凋亡率显著低于IR组。以上研究结果提示，腺苷可通过降低脑组织细胞凋亡来改善CIRI。

细胞凋亡除有死亡受体途径、线粒体途径，还有ERS[16]。合成、加工及转运蛋白需在内质网这一重要细胞器中进行，缺血缺氧会导致内质网功能紊乱，诱导一些未折叠的蛋白及错误折叠的蛋白，这些错误蛋白聚集在内质网内从而影响内质网正常生理功能，进而导致细胞凋亡。细胞对未折叠的蛋白及错误折叠的蛋白做出的应对反应为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)。UPR主要通过激活3种跨膜蛋白的激活发挥调节作用，分别是内质网膜应激传感器蛋白激酶RNA样内质网激酶、肌醇需要酶、激活转录因子6，这3种跨膜蛋白均可激活CHOP的表达[17]。CHOP在生理状态下以很低的表达水平存在于细胞质中，当ERS发生时其表达量显著增加。CHOP为内质网相关促凋亡蛋白，是ERS启动细胞凋亡的重要位点。研究表明，柚皮甙[16]、大黄酚[18]等药物预处理及低温预处理[19]、电针预处理[20]等方法可通过抑制CHOP表达来抑制细胞凋亡，进而减轻CIRI。本研究结果显示，IR组和AP组大鼠脑组织中CHOP mRNA相对表达量和CHOP 蛋白阳性细胞表达率显著高于假手术组，AP组大鼠脑组织中CHOP mRNA相对表达量和CHOP 蛋白阳性细胞表达率显著低于IR 组，这说明，脑缺血再灌注可使大鼠脑组织CHOP mRNA及CHOP蛋白的表达量显著升高，而AP使大鼠脑组织CHOP mRNA及CHOP蛋白的表达量显著降低，提示腺苷改善CIRI可能与其抑制CHOP的表达有关。推测其机制可能是：正常生理状态下ESR未被启动，CHOP未被激活，处于静息状态；当细胞发生缺血再灌注时，细胞为应对ERS出现未折叠蛋白反应，从而激活CHOP，使CHOP呈高表达状态，进而诱导细胞凋亡发生，造成脑组织损伤，出现神经功能缺损症状；AP使CHOP的表达降低，从而减轻细胞凋亡程度，改善脑组织损伤及神经功能缺损症状。

综上所述，腺苷可能通过抑制CHOP的表达，抑制ESR，进而抑制细胞凋亡，从而减轻CIRI，发挥脑保护作用；这为腺苷的神经保护作用提供新的支持点，为AIS后CIRI的治疗提供新的治疗依据。