一株鸵鸟源新城疫病毒对鸡胚的毒力特性初探

谢 洋，曹紫梦，郜道玉，汤学超，唐瑞林，唐春燕，王家乡，李 鹏

（长江大学动物科学学院，湖北荆州 430025）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染疾病，主要发病特征是呼吸困难、严重下痢、黏膜和浆膜出血，病程稍长的伴有神经症状［1］。新城疫成为中国鸵鸟养殖中危害较大的传染病［2］，对鸵鸟的健康养殖影响巨大［3］，特别是从2017 年以后，鸵鸟新城疫频发，给广大鸵鸟养殖户造成了巨大的经济损失。在防控鸵鸟新城疫的临床实践中，于2019 年从河北省某鸵鸟养殖场送检的具有新城疫典型临床症状的1 日龄雏鸵鸟体内分离到1 株野毒株，通过试验确定该野毒株为新城疫强毒株。

1 材料与方法

1.1 病料来源

具有新城疫典型临床症状的病雏鸵鸟1 只，来源于河北省某鸵鸟养殖场，为送检样品。

1.2 试验材料

9～11 日龄SPF 鸡胚、3 日龄健康雏鸡，均购自湖北省荆州市川店镇峪口禽业有限公司；鸡红细胞、新城疫阳性血清及其他试剂仪器等均由长江大学动物科学学院实验室提供。

1.3 病毒的分离和鉴定

1.3.1 病毒的分离 取患病鸵鸟脑、肝、脾和十二指肠等病变组织加入PBS 溶液等体积混合并研磨匀浆。离心取上清液接种到10 枚9 日龄的SPF 鸡胚，0.2 mL/只，置于37 ℃培养箱孵育，24 h 后照蛋并去除死胚，继续孵化，照蛋取死胚放置在4 ℃冰箱，36 h后取出全部鸡胚并放置在4 ℃冰箱内过夜，在无菌条件下提取尿囊液备用。

1.3.2 血清学鉴定 将提取的鸡胚尿囊液与1%鸡红细胞按照经典的免疫学试验方法进行血凝试验，测定其血凝活性。用实验室提供的标准新城疫阳性血清与鸡胚尿囊液进行血凝抑制试验。

1.4 毒力指数的测定

1.4.1 鸡胚平均死亡时间（MDT）测定 将鸡胚尿囊液稀释10 倍，每个稀释度经尿囊腔接种10 只9 日龄SPF 鸡胚，每只接种0.1 mL，同时另设10 只9 日龄SPF 鸡 胚接种0.1 mL 无菌PBS 溶 液作为 对 照。37 ℃孵育，弃去24 h 内死亡的鸡胚，每隔2 h 照蛋1 次，连续观察120 h，观察记录鸡胚死亡时间。使所有鸡胚死亡的最高稀释度就是最小致死量（MLD）。MDT是MLD致死鸡胚的平均时间，强毒株为40～60 h，中毒株为60～90 h，弱毒株为90 h 以上。MDT按下列公式计算：MDT=（X时死亡鸡胚数×X时+Y时死亡鸡胚数×Y小时+Z时死亡鸡胚数×Z时+……）/死亡鸡胚总数。

1.4.2 3 日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）测定 将鸡胚尿囊液稀释10 倍，脑内接种10 只3 日龄SPF 雏鸡，每只接种0.1 mL，同时另设10 只9 日龄SPF 鸡胚接种0.1 mL 无菌PBS 溶液作为对照。所有雏鸡置温箱内隔离饲养8 d，每天观察并记录雏鸡的生理状况，按照正常得0 分，患病得1 分，死亡得2 分，累计病鸡数和死亡鸡数的积分。ICPI是3 日龄鸡脑内接种致病指数，根据OIE 提供的毒力鉴定分型标准：ICPI达0.2～0.6，为温和型（弱毒株），0.5～1.0 为中等毒力型，1.5～2.0 为速发型（强毒力型）。ICPI按下列公式计算：ICPI=（累积死亡鸡数×2+累积发病鸡数×1）/鸡的累积总数。

1.4.3 半数致死量（ELD50）的测定 将该病毒溶液用生理盐水连续稀释10 倍至10-9～10-5，并将每个稀释的溶液用9 日龄的非免疫鸡胚尿囊腔接种，每个鸡胚接种0.2 mL 病毒液，每个稀释度组中接种5个鸡胚，封蜡后在37 ℃培养箱中温育。每天观察鸡胚的状态，丢弃24 h 内死亡的鸡胚，并且每天观察2次，直到72 h。记录鸡胚死亡。然后根据Reed-Muench 法［4］计算ELD50。

2 结果与分析

2.1 血清学鉴定结果

将分离保存的尿囊液进行血凝和血凝抑制试验。结果显示，该毒株能够凝集1%鸡血红细胞，而且其血凝特性能够被新城疫标准阳性血清抑制。根据此结果可确定该分离到的毒株为新城疫病毒，暂命名为NDV-HB2019 株。

2.2 鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定结果

由表1 可知，能够使鸡胚全部死亡的最高稀释倍数为10-7，且在36 h 时死亡的鸡胚数为1 枚，48 h时死亡的鸡胚数为2 枚，60 h 时死亡的鸡胚数为2枚，以上的数据用公式计算可以得出鸡胚平均死亡时间MDT为50.4 h。

表1 MDT 的测定结果

2.3 3 日龄鸡脑内接种致病指数（ICPI）测定结果

由表2 可知，鸡胚尿囊液对雏鸡有很强的致死作用，死亡率较高；对照组注射生理盐水后全部正常存活。根据国际上ICPI的计算公式可得ICPI为1.71。

表2 ICPI测定结果

2.4 半数致死量（ELD50）的测定结果

从表3 可知，测定的ELD50在10-8～10-7，按照数据并结合Reed-Muench 方法计算ELD50可得每0.2 mLELD50为5×10-7.4。

表3 ELD50的测定结果

3 讨论

新城疫是由新城疫病毒引起的一种急性高接触性传染病，又被称作“亚洲鸡瘟”，作为被OIE 规定必须予以报告的疫病是严重危害养禽业的重要疾病。薛应照等［5］、尹燕博等［6］研究发现，有的患病鸵鸟会出现颈部扭转、弯曲并出现神经症状，排出黑色稀粪等症状。研究者分析发现，剖解时可以观察到气管和喉头黏膜有出血点、腺胃水肿、乳头有出血点、肌胃角质层易脱落、角质层下有出血点或出血斑、小肠黏膜严重渗出性出血、结肠和直肠的黏膜有出血点、心包外膜可见有喷洒状出血、大脑和小脑表面血管充血、脑出血等病理变化［7-10］。本试验中观察到该病雏鸵鸟颈部扭转、弯曲并出现神经症状，内部解剖特征与孙矗等［7］的研究报道一致，为鸵鸟新城疫的快速诊断提供了临床依据。

NDV 根据不同致病菌株感染的家禽的不同表现形式可分为3 种致病类型［11，12］：速发型（强毒株）的菌株，对所有年龄段的易感禽造成急性感染性死亡；中发型（中毒株）的菌株中，只在易感幼禽引起致命感染；缓和型，低毒或无毒菌株，轻度呼吸道感染的临床表现或肠道感染，无临床症状。NDV 的毒力测定需根据鸡胚平均死亡时间（MDT）、3 日龄鸡胚脑内接种致病指数（ICPI）和6 周龄鸡静脉接种致病指数（IVPI）及半数致死量（ELD50）的测定。

由于新城疫病毒不同分离毒株的毒力不同，判定毒力大小常用的毒力测定指标MDT、ICPI、IVPI有时并不完全一致，所以在这3 种判定指数中，需2 种或2 种以上指标综合分析才能判定毒株的致病性强弱［13，14］。判断新城疫病毒强毒株毒力的国际通用标准是MDT为30～60 h，ICPI＞1.6。在本试验中测得MDT为50.4 h，ICPI为1.71，每0.2 mLELD50为5×10-7.4，符合强毒型毒株判定标准，故根据试验结果可以判定本次分离的NDV-HB2019 株为强毒株，为下一步对其进行分子生物学特性研究和疫苗候选株筛选打下了基础。