仁青常觉对胃动力低下大鼠胃残留率、5-HT 以及c-kit 表达的影响*

2023-04-11罗布占堆达瓦卓玛任海龙卓玛东智谢红军潘永越

西藏科技 2023年1期

罗布占堆达瓦卓玛任海龙卓玛东智谢红军潘永越

（西藏大学医学院，西藏拉萨 850000）

胃肠动力障碍（DGIM），是当下胃肠疾病的主要缘由［1］。胃肠动力障碍常常表现为食少饱胀、消化不良等，其主要是由胃肠平滑肌运动障碍导致的。由于运动电位主频以及平均振幅的改变，导致了神经支配调节障碍［2］。根据流行病学调查发现，DGIM患者占据了胃肠科病患的50%，严重影响着患者的生活质量及经济支出等，因此对DGIM 的治疗是目前临床研究的重点［3］。

然而，西药的长期使用常常导致停药后的反复发生，诱导的不良反应使得临床效果受限。传统医药较少的毒副作用完全符合了DGIM 的病症迁延及持续发作的特征，因此重新被人们所重视［4］。先前的研究认为，半夏厚朴汤加减可改善DGIM 的胃肠道及其肺功能［5］等。而香砂平胃汤也可作为DGIM 治疗的手段［6］。

仁青常觉是藏区广泛使用的，用于治疗各种疾病的复方。其主要特征是基于多种稀有藏药混合而成，并且还有多种微量金属元素［7,8］，而其对DGIM 的作用尚未得到全面验证。因此，本研究的目的是调查仁青常觉对甘草诱导的胃动力不足大鼠的平滑肌的作用机制。

1 实验方法

1.1 仁青常觉的活性成分石油醚提取

根据先前的研究，笔者采用了仁青常觉（西藏甘露藏药股份有限公司，国字药准字Z54020057）的石油醚提取物作为本研究的方法［9］。提取过程如下：取仁青常觉研细后的细粉，加入体积重量比为6 倍的石油醚沸腾提取3 次，每次1 小时，40℃～50℃减压回收石油醚，得到仁青常觉石油醚提取物。

1.2 胃动力低下模型的建立

胃动力低下模型的建立是在税典奎等人的研究所进行［3］。即采用制备的甘草（安徽井泉集团中药饮片有限公司，批号：20090301）煎剂对SD 大鼠进行灌胃处理，每只10g/kg，持续5 天。

将模型大鼠随机分为5组，分别为对照组，阳性组，低剂量组，中剂量组，高剂量组。对照组为0.9%生理盐水+10g/kg 甘草煎剂；阳性组为10g/kg 甘草煎剂+0.4mg/mL 西沙比利；低（0.1g/kg）、中（0.2g/kg）、高（0.4g/kg）剂量组［10］为不同浓度的仁青常觉提取+10g/kg 甘草煎剂，持续5 天。

1.3 胃残留率检测

第5 次给药后，大鼠禁食不禁水12h，随后0.002 g/mL 苯酚红溶液灌胃进行胃残留率测定。灌胃20min 后，大鼠安乐死，摘取胃。0.002g/mL 苯酚红溶液按1:10 加入0.1mol/L 的 NaOH 溶液，随后采用按1:5比率溶解于纯水中，测定溶液560nm下吸光度，并作为标准液。随后将胃浸入0.1mol/L 的 NaOH 溶液，充分洗涤，收集上清液，同样的比率溶于纯水中，测定OD560nm 吸光度，记录为测定液。胃残留率（%）=测定液 OD 值/标准液 OD 值×100%.

1.4 免疫组化检测c-kit 以及5-HT 的表达

将获得的胃组织石蜡包埋，切片。随后经过脱蜡水化，自来水清洗，PBS 清洗，柠檬酸钠修复，H2O2以及血清封闭等。5-HT（Abcam，1:1000），c-kit（Abcam，1:4000）抗体孵育。随后SP-9001 兔SP 试剂盒（中杉金桥）中生物素化以及HPR 标记的抗体孵育，DAB（中杉金桥）显色。复染，脱水，透明后封片，显微镜下观察拍片。Image J pro 软件分析相对表达量。

2 实验结果

2.1 仁青常觉石油醚提取物对为残留率的影响

胃残留率是胃肠动力障碍的指标之一，图1 及表1 的结果说明，在胃动力低下的对照组中，胃排空受到抑制，残留率达到了72.89%.西沙比利显著的促进了胃排空，胃残留率下调为49.60%.仁青常觉对胃残留率有一定的抑制作用，然而与对照组相比较，只有高剂量的仁青常觉（0.4g/kg）起到了显著的作用（p=0.008），而低剂量（0.1g/kg）和中剂量（0.2g/kg）的仁青常觉未能发挥显著的作用，p 值分别为0.974以及0.098。这一结果提示我们，在后续仁青常觉的剂量有待做一步的提高及细胞毒性的研究。

图1 各组大鼠胃残留率的变化（%）（n=3）

表1 各组大鼠的胃残留率（%）（n=3）

2.2 仁青常觉石油醚提取物对5-HT 表达的影响

为了验证仁青常觉石油醚提取物对胃肠动力障碍的作用机制。我们对胃体、胃底组织进行了5-HT含量检测。在对照组中，5-HT 相对表达很少，说明甘草对胃底，胃体中5-HT 的释放有一定的抑制作用，这与先前的研究结果是一致的［3］。而阳性组不论是胃底还是胃体，5-HT 水平大幅提高，具统计学意义。中高剂量的仁青常觉对5-HT 的释放具有促进作用明显（p ＜0.01）；剂量组胃体中5-HT 与对照组比较的p 值0.257，不具有统计学意义；而胃底与对照组的比较p 值小于0.05，差异显著。

图2 胃体及胃底中5-HT 的相对表达量（n=3）

2.3 仁青常觉石油醚提取物对c-kit 表达的影响

c-kit 的表达、突变与胃肠平滑肌功能紊乱及间质肿瘤发生的相关性已被证明［11］。因此，在本研究中，笔者检测了胃底、胃体中c-kit 的表达，以验证仁青常觉是否能够通过调节c-kit 的含量，影响胃肠平滑肌的功能。在对照组中，可以看到肌间神经丛周围的c-kit 含量较少，而阳性组中可明显看到大量棕黄色c-kit 的存在。在仁青常觉低剂量组中，c-kit 的表达与对照组相近，而0.2g/kg 以及0.4g、kg 的仁青常觉显著的促进了c-kit 的表达，高剂量的c-kit 表达略高于阳性组，p 值分别为0.657（胃底），0.172（胃体）。

3 讨论

仁青常觉作为一种为数不多的复方藏药，主要成分包含珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、诃子、牛黄、人工麝香、西红花等。在《四部医典》中被记录为“强身健体，增强免疫力”等，在临床上对治疗、干预胃肠炎、胃溃疡、宫颈癌、哮喘等有独特疗效且临床安全评价较好［12-16］。

表2 5-HT 在各组大鼠中的相对表达量（n=3）

图3 c-kit 在各组大鼠胃底、胃体中的相对表达量（n=3）

研究认为，SCF/c-kit 信号通路的上调是胃肠动力改善的机制之一［17,18］。而Cajal 间质细胞的钙库受体蛋白IP3R，Ry R 以及PLC 表达的上调被认为介导了C-kit表达的增加［19］。肌间神经丛中5-羟色胺（5-HT）是调节胃肠平滑肌运动的因子，5-HT 的缺陷可导致大脑以及胃肠道功能障碍。而5-HT 的含量的变化也是5-HT APUD 细胞数的一个体现［20］。5-HT APUD细胞数目的减少，导致了5-HT 分泌的减少，胃平滑肌的运动功能减弱。在本研究中，我们发现仁青常觉显著了增加了胃动力低下大鼠胃底、胃体中c-kit 以及5-HT 的表达，并且胃排空能力也得到改善。因此，我们初步认为仁青常觉可通过上调c-kit 以及5-HT 的水平提高平滑肌动力，从而缓解胃动力不足的症状。