ApoE基因多态性与2型糖尿病患者颈动脉粥样硬化斑块的相关性分析

孟令萃 乔妙 乔利军 杨爽 赖丹惠 叶思婷 周婷 张建兴

2型糖尿病(type 2 diaberes,T2DM)是常见的一种慢性代谢性疾病,且全身动脉粥样硬化发病率较高,随着病程进展,常合并脑卒中等严重的血管疾病,从而使全身各靶器官受到相应损伤[1]。而动脉粥样硬化是各级血管病变的早期结构及功能改变,是心脑血管疾病的独立危险因素,而血脂代谢异常是导致动脉粥样硬化的重要原因,尤其与低密度脂蛋白(LDL-C)、三酰甘油(TC)增高关系最为密切,同时受性别、年龄及高血压、吸烟等因素的影响[2]。载脂蛋白E(ApoE)基因具有多态性,是人体重要的载脂蛋白之一,是参与调节血脂代谢的重要因子,其基因多态性与血脂水平密切相关,不同基因型转录的蛋白质存在氨基酸的差异,使其对LDL受体的亲和力不同,影响脂蛋白代谢和血脂水平,从而影响颈动脉粥样硬化病变的发生、发展[3]。颈动脉是公认的动脉粥样硬化的主要观测部位,动脉粥样硬化病变程度可通过检测颈动脉内-中膜厚度(IMT)值及斑块情况进行评估[4]。探讨ApoE基因多态性与颈动脉粥样硬化的关系,从中发现不同基因型对T2DM患者颈动脉粥样硬化的影响,找出危险因素和遗传易感性标志,为临床早期诊断和预防颈动脉粥样硬化提供有价值的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2019年9月至2021年2月我院内科住院的461例患者;其中男263例,女198例;年龄30～79岁,平均年龄(60.78±7.27)岁;其中T2DM患者226例,男136例,女90例;年龄32～77岁,平均年龄(61.02±6.86)岁;非T2DM患者235例,男127例,女108例;年龄30～79岁,平均年龄(60.56±7.65)岁。本研究经广州中医药大学第二附属医院伦理委员会审核通过。

1.2 标准

1.2.1 T2DM诊断标准:参照中华医学会糖尿病学分会2020年制定的《中国2型糖尿病防治指南(2020年版)》[5]:典型糖尿病症状伴随机血糖≥11.1 mmol/L,或空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L;或口服糖耐量试验餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L,或糖化血红蛋白(HbA1c)≥6.5%。

1.2.2 纳入标准:①糖尿病组符合T2DM的诊断标准;②对照组符合糖尿病排除标准;③入院48 h内接受颈动脉超声检查;④具有完整的临床资料。

1.2.3 排除标准:①心、肺、肝及肾严重功能不全;②1型糖尿病;③继发性糖尿病;④严重感染;⑤恶性肿瘤;⑥神经、精神障碍;⑦严重风湿;⑧临床资料不完整。

1.3 方法

1.3.1 基线资料:收集461例患者的性别、年龄、身高与体重[计算体重指数(BMI)]、吸烟史、饮酒史、高血压史、冠心病史、中风史;实验室检测:TG、LDL-C、高度密脂蛋白(HDL-C)、TC、空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)及ApoE基因多态性检测。

1.3.2 ApoE基因测定:患者12 h清晨空腹采集肘静脉血5 ml置于EDTA抗凝管,提取全血细胞基因组DNA根据血液基因组DNA提取试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司,货号:NGB-51400)说明书进行。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增ApoE特定基因片段,参照人类ApoE基因多态性检测试剂盒(弗元(上海)生物科技有限公司,货号:FYG-rs429358)进行ApoE基因多态性测定[6]。

1.3.3 血液生化指标检测:患者空腹12 h后于清晨采集肘静脉血,加入抗凝管并送到检验科检测,测定TG、TC、HDL-C、LDL-C、FBG(采用7170A型全自动生化分析仪,试剂盒均购自中国上海罗氏诊断产品有限公司)、HbA1c(采用糖化血红蛋白检测电泳仪,购自法国Sebia公司)。

1.3.4 颈动脉彩超检查:患者的超声检查均由专业从事血管超声检查的医师完成(工作时间>5年),检查仪器为Philips Elite彩色多普勒超声诊断仪(荷兰),探头频率为7～10 MHz,患者采取仰卧位,将枕头置于颈部,头后仰,从颈动脉起始处,颈内动脉、颈外动脉连续纵、横切面检查,观察颈动脉至分叉处的内-中膜及斑块情况。颈动脉分组:根据参考文献[7]分为2组:①无斑块组:双侧颈动脉内膜均无斑块形成,且颈动脉IMT<1.5 mm;②斑块组:一侧或以上IMT≥1.5 mm或内膜有斑块形成,对于有斑块形成者,依次测量双侧颈动脉每个独立斑块的厚度,将测得的所有独立斑块厚度相加后即为颈动脉斑块Crouse积分[8]。

2 结果

2.1 2组患者一般资料比较 2组患者BMI值、高血压病史、冠心病史、LDL-C、HDL-C、TG、HbA1c、FBG、颈动脉双侧内-中膜(LIMT、RIMT)和斑块Crouse积分差异有统计学意义(P<0.05),2组患者间性别比、年龄、吸烟史、饮酒史比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组患者临床基本资料比较

2.2 2组患者ApoE基因型及等位基因频率比较 纳入461例患者,共检出6种基因型(ε2/2、ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4、ε4/4)及 3 种等位基因(ε2、ε3、ε4)。纳入人群ApoE基因分布情况符合H-W遗传平衡定律和连锁平衡,可代表整个群体。本研究将基因型分为3个表型组,ε2/2和ε2/3合并为ε2组;基因型ε3/4和ε4/4合并为ε4组。由于ε2/4基因型由等位基因ε2和ε4共同组成,等位基因ε2 和ε4对动脉粥样硬化的作用相反,不归入上述各组,故比较基因型频率时剔除基因型为ε2/4基因型的病例。T2DM组ε3/4 基因型频率显著高于非T2DM组,ε3/ε3基因型频率显著低于非T2DM组(P<0.05)。T2DM组ε4等位基因表型频率显著高于非T2DM组,ε3等位基因表型频率显著低于非T2DM组(P<0.05)。见表2、3。

表2 2组患者等位基因表型频率比较 例(%)

表3 2组患者基因型频率比较 例(%)

2.3 不同基因型T2DM合并颈动脉斑块患者血脂水平及颈动脉IMT值、斑块情况比较 3组等位基因表型间TC、TG、LDL-C水平差异具有显著性,其中ε4组>ε3组>ε2组(P<0.01);HDL-C水平差异无显著性(P>0.05),但ε2组>ε3组>ε4组;3组等位基因表型间双侧IMT值及斑块Crouse积分差异有显著性,ε4组>ε3组>ε2组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组等位基因血脂及颈动脉IMT、斑块情况比较

2.4 T2DM合并颈动脉斑块患者总Crouse积分与危险因素的相关性分析 以T2DM合并颈动脉斑块患者斑块Crouse积分为因变量,以各种危险因素为自变量,进行相关性分析,发现年龄、BMI值、高血压史、冠心病史、中风史、LDL-C、HDL-C、HbA1c、ε4等位基因表型与颈动脉斑块Crouse积分具有明显相关性(P<0.05),而吸烟、饮酒、胆固醇、TG、ε3等位基因表型没有明显相关性(P>0.05)。见表5。

表5 T2DM患者合并颈动脉斑块总Crouse积分的相关性分析

2.5 ε4等位基因表型预测T2DM合并颈动脉斑块风险的ROC曲线 ε4等位基因表型预测T2DM合并颈动脉斑块形成风险的ROC曲线下面积(AUC)为0.691,敏感度为41.7%,特异度为94.7%,表明ε4等位基因对T2DM合并颈动脉斑块发生风险有一定的预测价值。见图1。

图1 ε4等位基因预测T2DM合并颈动脉斑块风险的ROC曲线

3 讨论

随着近年人们生活水平日益提高及生活方式的改变,糖尿病的发生率日趋上升,已成为全球关注的健康问题。T2DM患者多为中老年群体,随年龄增加患病率逐渐增高,常伴有脂质代谢紊乱[9]。有研究表明,脂质代谢异常往往与糖代谢紊乱相比更较前发生,其突出特点为TG水平升高,同时循环游离脂肪酸(FFA)水平伴随增高,从而进一步加速TG水平的进一步升高,降低与胰岛素抵抗相关的血浆HDL-C水平,高TG或低HDL-C水平通过炎症介导或低HDL-C水平影响胰岛β细胞的功能,进而影响胰岛素的正常分泌,从而加快T2DM的进展[10,11]。本研究结果表明,与非T2DM患者相比,T2DM患者脂质代谢紊乱更为突出,表现为血脂LDL-C、TG水平明显增高,而HDL-C水平明显减低。在T2DM患者中,脂质代谢紊乱的患病率为72%～85%[12],脂蛋白脂酶(LPL)、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、磷脂转移蛋白(PTP)、内皮脂酶(EL)和肝脂酶(HL)的活性受胰岛素抵抗影响影响,同时还会抑制ApoE的生成率和乳糜微粒的分泌[13]。尽管ApoE基因的研究还有限,但都有力地的证实了ApoE基因与糖尿病脂代谢紊乱密切相关[14]。

载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因位于人体第19号染色体上,常见的3种等位基因ε2、ε3和ε4分别表达3种ApoE异构体ApoE2、ApoE3和ApoE4。ApoE基因多态性存在6种不同基因型,包括ε2/2、ε3/e3、ε4/4(3种纯合体)和ε2/3、ε3/4、ε2/4(3种杂合体)。ApoE基因是人体日常所需的重要的功能蛋白,通过多态性的蛋白形式参与脂蛋白的转化与代谢过程,与脂代谢紊乱和动脉粥样硬化的发生、发展密切相关[15]。既往研究表明3种蛋白基因亚型因结构不同而对脂质代谢的影响有所不同,其中ε4等位基因携带者伴有TC、TG、LDL-C水平的增高,其升高的趋势为ε4>ε3>ε2[16]。本研究中,T2DM组携带ε4等位基因(ε3/4+ε4/4)其TC、TG和LDL-C水平较非T2DM组均升高,提示ε4等位基因与糖尿病患者的代谢密切相关,这可能与糖尿病患者本身脂质代谢紊乱,ApoE等位基因受体活性结合能力减低,从而导致富含TG的脂蛋白分解缓慢,进而肝脏摄取、处理乳糜微粒(CM)、VLDL-C残粒发生障碍,使血中的TG升高,表现为高TG、TC和LDL-C水平[17]。

既往研究证实,糖尿病机体血糖升高诱导血管内皮细胞发生氧化应激反应和炎性反应,导致内皮依赖性血管收缩及舒张功能障碍,同时诱发粒细胞及单核细胞对内皮细胞的炎性损伤和粘附,从而启动并促进早期动脉粥样硬化的发生[18]。同时由于糖尿病患者常伴有代谢异常的危险因素,如年龄、性别、不良生活方式和心血管病家族史等相关因素,常常伴有脂质代谢紊乱,随着LDL-C升高,促进大量脂质颗粒在细胞内及血管壁上沉积,引起动脉粥样硬化的早期病理改变,通过LDL-C氧化修饰,大量巨噬细胞吞噬的脂质颗粒却难以分解,在巨噬细胞内沉积后形成泡沫细胞,泡沫细胞积聚之后形成脂质核心并逐渐形成粥样硬化斑块[19]。本研究也证实,T2DM组患者颈动脉内-中膜厚度及颈动脉斑块Crouse积分明显增高,同时BMI值增高,合并高血压及冠心病等代谢紊乱高危因素明显增多。糖尿病患者动脉粥样硬化斑块的发生、发展存在多样性,ApoE基因多态性与脂质代谢紊乱和动脉粥样硬化的发生、发展密切相关[15]。荟萃分析显示ApoE基因多态性与颈动脉IMT之间显著相关,但由于纳入的受试者为东亚人群,无白人符合纳入标准[20]。因此,关于T2DM患者动脉粥样硬化的临床类型需要进一步的遗传学研究,探索其是否ApoE基因受多态性的影响[21]。

研究证明,ApoE基因ε4等位基因通过升高血浆TG、TC、LDL-C的水平从而影响机体血脂水平,并促进动脉粥样硬化改变过程[22],本研究中T2DM合并颈动脉斑块患者中ε4等位基因组携带者血清TG、TC、LDL-C较非ε4组高。提示ApoE基因多态性是人群中TG、TC和LDL-C水平存在个体差异的遗传性决定因素,而ε4等位基因可能就是动脉粥样硬化的遗传性易感因子。

本研究中T2DM合并颈动脉斑块患者与ε4等位基因及年龄、BMI值、高血压史、冠心病史、中风史、LDL-C、HDL-C具有明显相关性,同时通过ROC曲线证明ε4等位基因对T2DM患者合并颈动脉斑块的具有较高诊断价值,且ε4等位基因存在时血脂、颈动脉IMT、颈动脉斑块Crouse积分明显增高,因此在2型糖尿病人群中,ε4等位基因与动脉粥样硬化斑块有关,提示ε4等位基因可能通过影响T2DM患者的血脂代谢,从而在一定程度上影响动脉粥样硬化病变的进程。

综上所述,T2DM患者人群脂代谢紊乱较明显,而ApoE基因多态性与颈动脉粥样硬化斑块的发生发展具有明显相关性,ε4等位基因对T2DM合并颈动脉斑块具有较高预测价值。因此,对T2DM人群进行血脂水平动态观察和ApoE基因多态性检测,深入研究ApoE的基因表达和调控,有利于对动脉粥样硬化的早期预测,对其危险因素尽早进行干预,从而预防进一步心脑血管疾病的进展。