无细胞生物传感器及其在食品与生物检测应用中的研究进展

王佳佳，王 鑫，庞晓旭，黄昆仑,2，许文涛，罗云波,2，程 楠,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，食品质量与安全北京实验室，北京 100083；2.农业农村部农业转基因生物安全评价（食用）重点实验室，北京 100083；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100083）

生物传感器主要由分子识别和检测信号输出元件组成[1]，是用于检测微量物质的工具，具有专一性强、准确度高、能在线分析等优势[2-4]。近几十年来，细胞生物传感器以微生物全细胞作为识别元件[5]在污染物[6]、化学成分[7]以及微量元素[8]检测等领域得到了快速的发展。然而，活细胞系统的复杂性导致其必然存在一些天然的缺陷，例如，细胞膜限制检测范围[9-10]、跨膜运输使响应时间长[10]、实验细胞释放存在安全隐患[11]等。

生物技术的快速发展使生物学家可准确地改造生物基因，继而生产出所需的生物大分子。而合成生物学发展前期，主要是基于细胞对蛋白质工程化设计，但复杂的活细胞生命系统、细胞的生长与预期计划不一致等问题，极大地限制了合成生物学发展。为了打破这些限制，一项新的工程技术——无细胞合成生物学诞生了。无细胞合成生物学的发展促进了无细胞系统的开发，很好地弥补了细胞生物传感器的缺陷。无细胞系统以DNA或mRNA作为模板，利用分离的细胞成分（例如核糖体和重组蛋白）或细胞粗提取物[12]，在开放的环境中添加反应底物、化学物质（可以是具有细胞毒性的物质[13]）和辅助因子进行转录和翻译以表达蛋白质[14]，整个构建流程可在几小时内完成[15]。此外，无细胞系统内的能量物质均用于目标反应，而非自我复制，极大提高了能量利用率[16]。基于无细胞系统设计的无细胞生物传感器还具有诸多优点[17]。例如，不需要活细胞生物参与控制，且不存在转基因生物释放问题[18]，便于户外操作；可检测细胞毒性物质[18]，检测范围更广；运用了冷冻干燥技术可使无细胞体系具有较长的储存期[19]；检测限可以达到zmol级别[20]，灵敏度更高；当存在抑制或杀死活细胞的毒素时，系统也可正常运行[21]，具有良好的毒性耐受性；待测物可与识别元件直接接触反应，从而更快产生信号[18]，大大缩短响应时间；没有细胞生长等培养过程[22]，缩短生物传感器构建时间。

本文对近几年基于不同平台的无细胞生物传感器进行分类（表1），综述了不同类型无细胞生物传感器的研究进展，概述了无细胞生物传感器在金属离子、农药与兽药残留等领域的检测情况，旨在为无细胞生物传感器的研究发展提供参考。

表1 无细胞生物传感器在实际应用中的分类汇总Table 1 Summary of the applications of cell-free biosensors

续表1

1 无细胞生物传感器

无细胞生物传感器是在无细胞体系中进行，首先敏感元件（转录因子等）特异性识别并结合待测物，下游基因随后被激活从而引发转录翻译过程，最终输出信号（例如颜色变化、荧光、电信号）[10]。如图1所示，目前，基于不同平台设计的多种无细胞生物传感器被广泛应用于环境检测[9,28]、食品安全检测[39,53]、疾病诊断[17,49]等领域。

图1 无细胞生物传感器原理Fig.1 Schematic diagram of the working principle of cell-free biosensors

1.1 识别反应机制

生物传感器作为分析装置，其核心是利用生物分子进行特异性识别机制[55-56]。随着待测物种类增多，传统的识别元件（如酶、抗体）在多样化应用中受限，新型识别元件有待深入研究。以下将介绍几种目前已用于无细胞生物传感器的识别元件，为将来设计新的识别元件提供思路。

1.1.1 转录因子

转录因子是一种具有特定结构的蛋白质分子，可与基因特异性结合，并在特定的时间和地点以特定的强度调控基因的转录过程[57]，这种调控既可激活也可抑制。例如，转录因子ArsR响应金属离子As3+[38]，当待测物中不存在As3+时，转录因子ArsR与启动子的RNA聚合酶结合位点结合，从而阻止转录。当As3+存在时，ArsR会与As3+特异性结合，发生构象改变，继而从RNA聚合酶结合位点脱落，RNA聚合酶方可与启动子结合，进而下游基因表达，产生颜色变化；转录因子LasRV能够对酰基高丝氨酸内酯（acyl homoserine lactones，AHL）产生响应（图2）[17]，当在无细胞体系中加入囊性纤维化患者痰样时，基因LasR表达出的转录因子LasRV与痰样中的AHL特异性结合，进而激活下游启动子表达，产生荧光现象，检测限为4.9 nmol/L。利用无细胞生物传感器检测仅需2.5 h即可观察到样品间的差异[17]，证明了无细胞生物传感器用于快速检测具有可行性。此外，当待测物没有与其对应的配体时，可通过代谢酶将转录因子不可识别的待测物转化成可检测的配体进行检测[30,34]。然而，转录因子存在会与除待测物以外物质反应的问题[10]，有待进一步研究。

图2 AHL响应型LasRV生物传感器原理示意图[17]Fig.2 Schematic diagram of AHL responsive LasRV biosensor[17]

1.1.2 Toehold开关

Toehold开关是一种由两条RNA组成的可编程工程元件[58]，利用发卡结构来隔离核糖体结合位点（ribosome binding site，RBS）和起始密码子以阻止顺式基因翻译启动[41]。Toehold开关因其较好的特异性以及可识别任意核酸序列，常被用作检测核酸的无细胞生物传感器识别元件。例如检测呼吸道合胞体病毒亚型A和B（图3）[42]，分别以呼吸道合胞体病毒亚型A和B为触发RNA设计开关，当触发RNA存在时，会与Toehold开关的立足点区域特异性结合，导致Toehold开关发生构象改变，暴露核糖体结合位点，从而激活β-半乳糖苷酶基因（LacZ）表达，产生从黄色到紫色的颜色变化。Toehold开关可以在布料、多孔氧化铝等多种材料中运行[40]，为便携性无细胞生物传感器开发提供了多个选择平台。然而，Toehold开关存在锁死或OFF状态下的基因表达问题，限制了其发展。目前主要通过使用12 nts环并结合更稳定的茎或将环域减少到11 nts[46]，以减少Toehold开关OFF状态下基因表达。

图3 Toehold开关设计原理[42]Fig.3 Schematic diagram of the principle for designing Toehold switches[42]

1.1.3 核糖开关

核糖开关是在转录或翻译水平上顺式调控表达的RNA元件[59]，由可与小分子配体特异性结合的适配子和调控基因表达的表达平台两部分构成[60-61]。相较于反式作用RNA和蛋白质调节，基于核糖开关识别的传感器只需调整一个DNA模板即可达到优化的目的[36]，操作更简化。如图4所示，在检测水中氟化物时，当有氟化物存在时，核糖体开关与其特异性结合，发生构象改变，下游基因表达，产生荧光；当没有氟化物时，核糖开关折叠成终止发卡结构，阻止下游基因表达，检测限为50 µmol/L[36]。然而，由于用于合成核糖开关的工程信号模块设计方法尚未完全明确，目前核糖开关数量有限[61]，基于核糖开关无细胞生物传感器的相关报道也较少。

图4 检测氟化物的核糖开关无细胞生物传感器示意图[36]Fig.4 Schematic diagram of riboswitch cell-free biosensor for fluoride detection[36]

1.1.4 成簇规律间隔短回文序列及相关蛋白系统体系

成簇规律间隔短回文序列及相关蛋白系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated，CRISPR-Cas）是古生菌和细菌中特有的一种适应性免疫系统[62]，依赖于DNA/RNA-RNA识别和结合来对核酸序列特异性切割[63]，根据不同的Cas效应器（Cas9、Cas12、Cas13等），CRISPR-Cas生物传感器系统有不同的剪切原理[64]，例如，CRISPR-Cas13a系统中，crRNA与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合体（ribonucleoprotein，RNP），直接切割目标探针显示荧光信号[65]。CRISPR-Cas系统具有易编程的特点，不仅可用于转录调控、基因编辑，还可以最小的成本将DNA双链断裂[63]，是目前无细胞生物传感器领域中新引入的识别机制，例如利用CRISPR-Cas9设计鉴别两种寨卡病毒菌种的无细胞生物传感器（图5）[46]，通过逆转录将触发序列附加到基于核酸序列的扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）技术扩增的病毒RNA上，Cas9切割具有PAM序列菌株的DNA片段，切割后的DNA片段无法与Toehold开关特异结合，而未切割DNA片段可与Toehold开关特异结合，促使下游Lacz基因表达，产生颜色变化，检测限为1 fmol/L；利用CRISPR-Cas9检测尿液或血液中RNA生物标志物[66]，一旦传感器接触到待测物的RNA，待测物RNA会与处于自阻遏状态的gRNA发生杂交，释放目标RNA并恢复与terR基因结合能力，继而Cas9进行切割，从而使绿色荧光蛋白基因不再被抑制，荧光强度增加。由于gRNA的额外序列可被重新设计，该生物传感器理论上拥有检测多种RNA生物标志物的能力[66]，但CRISPR-Cas系统存在脱靶等潜在风险[67]，以其作为识别机制的无细胞生物传感器还较为少见。

图5 基于CRISPR-Cas9检测寨卡病毒的无细胞生物传感器原理[46]Fig.5 Schematic diagram of cell-free biosensor for Zika virus detection based on CRISPR-Cas9[46]

1.1.5 其他

除上述的识别机制外，还有其他新型识别元件，例如利用缺乏氨基酸的无细胞合成蛋白系统（cell-free protein synthesis，CFPS）设计无细胞生物传感器定量检测氨基酸[37]。CFPS具有开放性，即允许改变体系中各种成分的浓度或替换内源性成分（如同位素标记、非天然氨基酸、荧光标记tRNA、突变核糖体）[68]。当体系中缺少特定的氨基酸时，翻译过程无法继续，加入含有特定氨基酸的样品后，翻译继续，产生荧光，检测限为100 nmol/L。该过程无需化学处理或色谱分离，几小时内即可准确测定出样品中氨基酸滴度，为氨基酸的定量提供了更实惠、灵活的选择。此外，还可利用抗生素氨基糖苷类与细菌30S核糖体亚基结合可抑制翻译的原理设计无细胞生物传感器检测血清抗生素[48]。当抗生素不存在时，T3 RNAP mRNA翻译出T3 RNAP，从而激活NanoLuc萤光素酶基因表达翻译，产生发光信号；当抗生素存在时，T3 RNAP mRNA和NanoLuc萤光素酶翻译受到抑制，导致信号减弱。虽然大部分传感器具有识别机制，但也有传感器不具有识别元件，例如利用抗生素抑制细菌蛋白合成检测抗生素[47]。当抗生素不存在时，LacZ表达，合成β-半乳糖苷酶，发生颜色变化；当抗生素存在时，β-半乳糖苷酶合成受到抑制，颜色无变化。

1.2 信号输出

1.2.1 比色信号

比色信号由于肉眼可见，常被用作无细胞生物传感器的输出信号。例如，LacZ表达产物可使黄色底物氯酚红-β-D-半乳糖吡喃糖苷变成紫色；儿茶酚-2,3-双加氧酶基因（XylE）表达产物可使无色低成本底物焦茶酚变成黄色[38]。LacZ的检测限略低于XylE[38]，且其表达产物β-半乳糖苷酶的催化速度快[40]，常被用作比色信号报告基因。然而，β-半乳糖苷酶是一种比荧光蛋白更大的蛋白质，转录翻译需要更多的能量，从而降低了其生成量[69]。目前，Ma Duo等[20]提出将蛋白分为α与w两部分，利用Toehold开关隔离LacZα序列，补充合成的LacZw不仅提高了β-半乳糖苷酶的生成量，还使检测时间缩短了23 min。

1.2.2 荧光信号

荧光信号作为另一种常见的无细胞生物传感器输出信号，常用荧光蛋白和荧光RNA适配体进行荧光表达。荧光无细胞生物传感不需要ATP来释放荧光，稳定性高、操作简单。并且，Lopreside等[26]通过实验发现荧光信号比比色信号响应时间更短，检测限更低。

荧光蛋白是一种可发荧光的蛋白质[70]。在特定激发光下，荧光蛋白发射光可用荧光计测量，且相对稳定、成熟时间短，因此常将其作为荧光生物传感器首选。荧光蛋白种类丰富，包括绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、翡翠绿色荧光蛋白（emerald green fluorescent protein，EmGFP）等。

荧光RNA适配体是一类可与小分子荧光团结合的RNA。这些小分子荧光团与绿色荧光蛋白中发现的荧光团相似，通常是没有荧光的，与其同源适配体结合后，会产生明显的荧光现象。例如：菠菜适配体与3,5-二氟-4-羟基亚苄基咪唑啉酮（3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone，DFHBI）结合产生绿色荧光[71]，西兰花适配体与(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-5(4H)-酮结合产生绿色荧光[72]，玉米适配体与3,5-二氟-4-羟基亚苄基-咪唑啉酮-2-肟结合产生黄色荧光[73]。荧光适配体即使荧光团被光漂白，也可以连续交换结合荧光团，产生荧光，具有比荧光蛋白更长的荧光寿命[74]。

1.2.3 生物发光

荧光素酶是一类在自然界中不需要激发光照射即能产生生物荧光的一类酶，可用于无细胞生物传感器光信号输出。在没有信号背景情况下，荧光素酶具有极大的线性范围（高达7～8 个数量级）[33]。Voyvodic等[34]利用萤火虫荧光素酶基因作为报告基因设计无细胞生物传感器检测可卡因，提高了信噪比。此外，NanoLuc荧光素酶具有高灵敏度和宽动态范围[75]，也可用于无细胞生物传感器设计[48]。

1.2.4 电信号

电信号利用电极捕获物质产生电流或电压变化进行检测，可用作无细胞生物传感器的输出信号。Mousavi等[53]利用电极捕获含有氧化还原标记的DNA产生电化学信号的原理设计无细胞生物传感器（图6）检测抗生素耐药基因，该传感器利用不同的Toehold开关激活后产生不同的限制性内切酶，实现同时检测多个抗生素耐药基因的目的，检测限为1 fmol/L。此外，Zhang Yan等[50]借助血糖仪读数，结合代谢模块设计无细胞生物传感器检测Zn2+。Zn2+与转录因子结合后，激活LacZ表达产生β-半乳糖酶，而β-半乳糖酶又将乳糖转化为葡萄糖，从而能够用血糖仪读数，输出电信号。

图6 基于纳米载体的多路电化学接口无细胞生物传感器原理图[53]Fig.6 Schematic diagram of multi-channel electrochemical interface cell-free biosensor based on nanocarriers[53]

1.3 生物传感平台

生物传感平台是传感器反应的载体，目前报道的无细胞生物传感器平台有以下5 种。1）溶液平台。基于溶液的无细胞生物传感器无需再经其他平台，可直接进行信号读取，并且成分在体系中分散更均匀。目前，基于溶液的无细胞生物传感器的相关报道比较多，其发展已经趋于成熟。2）纸张平台。通过冷冻干燥技术将细胞提取物、构建的基因网络等嵌入到纸张上，以创建具有细胞基本转录和翻译功能且无菌的纸张平台。基于纸张平台的无细胞生物传感器在室温下稳定、易于贮存、价格便宜，且只需加水即可激活[40]，已成为近几年的研究热点。3）电极平台。该平台生物传感器将工程分子组件与电子产品结合[49]，通过翻译板块输出葡萄糖，即可使用血糖仪进行数据读取。这些传感器不需再定制类似数据阅读器的基础设施，可降低成本。4）纳米载体。作为2021年国家重点研发项目的纳米载体具有放大信号[76]、催化反应[77]等优势，但基于纳米载体的无细胞生物传感器目前还较为少见，有待深入研究。5）微流体平台。微流体可使用微小通道来处理少量样品，具有能够缩短分析时间、减少昂贵试剂使用等优势，然而这类无细胞生物传感器的报道同样比较少。尽管目前无细胞生物传感平台不再单一，但除溶液外的平台研究还较少。未来一段时间内，进一步开发提升检测效率且便携的无细胞生物传感平台或成为该方向研究重点。

2 无细胞生物传感器在实际检测中的应用

2.1 金属离子检测

环境和食品中的化学污染物金属离子威胁着人类的生存和健康，金属离子含量高，会导致许多健康问题发生。

Pellinen等[9]早在2004年就以转录因子识别采用荧光素酶作为输出信号建立无细胞生物传感器检测Hg2+，然而并没有给出检测限。随着研究的深入，直到2019年，Gupta等[33]则将荧光素酶换成荧光蛋白设计传感器检测Hg2+，给出的检测限为1 µg/L。同年，Zhang Peng等[18]也在先前的工作基础上设计荧光无细胞生物传感器并检测了新的金属离子As3+，其检测限为661.005 nmol/L。由于溶液平台的无细胞生物传感器携带不便，Gräwe等[39]设计了基于纸张的荧光无细胞生物传感器检测Hg2+，并开发了一种与智能手机相结合的双滤镜系统，使户外检测更加方便，检测限为6 µg/L。

目前，无细胞生物传感器已用于检测Pb2+[28]、Zn2+[28,50]、Cu2+[28]、As3+[18,32,38]、Hg2+[9,18,26,33,39]和Cd2+[28]，其中检测Hg2+的研究较多，但其识别机制还局限于转录因子，检测金属离子种类有限，与便携设备联用比较少。因此，用于检测金属离子的无细胞生物传感器未来可探索新的转录因子或识别元件，进一步扩大检测范围；与血糖仪、智能手机、3D打印装置等便携设备结合使用，使数据读取更加精准方便。

2.2 农药和兽药残留检测

农药和兽药的过度滥用会导致其残存于环境、动植物体内或其代谢物中，对水土资源及食品造成污染，给人体健康带来危害。

Pellinen等[9]以荧光素酶基因构建的转录因子识别无细胞生物传感器用于检测四环素，检测限为10 ng/mL。随着无细胞生物传感器的发展，Jung等[28]利用荧光适配体设计的传感器检测四环素等污染物并应用于实际市政水样检测。此外，Silverman等[30]利用除草剂阿特津通过酶的作用可转换为氰尿酸的原理设计荧光无细胞生物传感器检测水样中阿特津，检测限为20 µmol/L，但是，并没有达到美国环境保护局对阿特津3 µg/L的检测限要求。随着对无细胞生物传感器平台的研究深入，低成本的纸张无细胞生物传感器开始出现。Duyen等[47]开发了一系列基于纸张的无细胞生物传感器，利用抗生素抑制β-半乳糖酶合成的原理，检测抑制细菌蛋白合成的抗生素帕罗霉素、四环素、氯霉素和红霉素，其检测限分别为0.5、2.1、0.8 mg/mL和6.1 mg/mL，并对真实水样进行了检测。为使数据读取更加方便准确，Amalfitano等[49]则结合血糖仪设计无细胞生物传感器检测四环素。

目前，已有基于溶液[9,28,30]、纸张[47-48]、纳米载体[53]和电极[49]平台的无细胞生物传感器检测农药和兽药残留，其中多数是检测水样中的抗生素，最低检测限为10 ng/mL，检测样品比较单一。未来，进一步提高无细胞传感器的特异性，将其应用于复杂的食品样品检测，可促进食品安全检测领域的快速发展。

2.3 病毒检测

近些年来，由病毒引起的疾病具有极高的发病率，利用无细胞生物传感器快速、灵敏、简便的优点检测病毒，已在临床诊断领域发挥功效。

Pardee等[40]构建的基于Toehold开关识别纸张无细胞生物传感器可肉眼检测埃博拉病毒，检测限为3 nmol/L。2016年，他们在先前构建的无细胞生物传感器的基础上，对Toehold开关进行了优化，并利用CRISPR-Cas9作为识别元件区分血浆中的不同的寨卡病毒毒株[46]。2018年，Ma Duo等[20]首次将磁珠技术用于无细胞生物传感检测的样品前处理，对粪便样本中的诺如病毒进行富集，使检测灵敏度提高了1 000 倍，检测限为270 zmol/L，尽管此设计可检测诺如病毒GII.4基因型，但无法检测近些年比较流行的GII.17基因型。Sun Qiuli等[43]则解决了这一问题，他们基于此前研究设计的纸张比色传感器可区分GII.4与GII.17基因型，检测限分别为0.5 pmol/L、2.6 fmol/L。NASBA是病毒检测常用的扩增技术，需要1～3 h。为缩短扩增时间，Park等[44]提出用逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated，RT-LAMP）技术代替NASBA，对唾液中的冠状病毒进行处理，检测限为3 fmol/L。此外，Nguyen等[45]将设计的检测埃博拉病毒的无细胞传感器置于两层亲肤的硅胶材料中间，实现了可穿戴目的。无细胞生物传感器也可与现有的数据读取设备结合，例如血糖仪。Tang Yidan等[51]利用转化酶可将底物蔗糖转化为葡萄糖，通过设计含有转化酶基因的Toehold开关识别寨卡病毒，最终通过血糖仪进行数据读取，检测限为20 copies。Amalfitano等[49]则选取海藻糖酶作为转化酶设计无细胞生物传感器检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2），检测限为100 copies。

目前，基于病毒检测的无细胞生物传感器设计流程较为成熟，通常基于纸张平台对病毒进行核酸扩增-Toehold开关识别-输出比色信号-便携设备数据读取。相较于传统的病毒检测手段，基于纸张的无细胞生传感器方便携带，不需要专业人员和大型仪器，在快速检测领域极具应用前景。

2.4 群体感应分子检测

群体感应（quorum sensing，QS）一直是食品安全和环境领域的研究重点，利用QS分子（包括AHL、N-3-氧十二烷基-L-高丝氨酸内酯等）可以开发控制细胞间通讯的药物和潜在抗菌剂[78]。QS是细菌通过对自身诱导物信号产生、释放和浓度的感应来调节基因表达的能力[23]。

Kawaguchi等[23]报道了一款基于转录因子识别的比色无细胞生物传感器可快速筛选群体感应分子中的AHL，通过肉眼即可看到颜色变化，检测限为100 nmol/L。而Yang等[27]则以荧光作为信号输出设计无细胞生物传感器筛选与腔链霉菌群体受体蛋白相互作用的群体感应分子。无细胞生物传感器不仅能用于群体感应分子的筛选，还可以用于检测临床样本，判断患者病情。Seto[54]设计的无细胞生物传感器可快速检测患者是否感染病理性铜绿假单胞菌。在铜绿假单细胞菌的毒性作用下，N-3-氧十二烷基-L-高丝氨酸内酯使转录蛋白从启动子中解绑，从而允许下游基因表达，产生荧光信号。

目前，利用无细胞生物传感器检测群体感应分子的报道还是比较多的，检测样本覆盖水样[18]、痰样[17]、细菌[27,54]。然而，其识别机制还限于转录因子。探索检测群体感应分子新的识别元件用于无细胞生物传感器设计，将是未来重点的研究方向。

2.5 其他

除上述外，无细胞生物传感器还用于苯甲酸盐、内分泌干扰素、氨基酸的检测以及教学工具的设计。苯甲酸盐是一种常见的食品防腐添加剂，其在食品中最高含量限制为0.1%。若向含有抗坏血酸的饮料中添加苯甲酸盐，苯甲酸盐会转化为低水平的苯（一种强致癌物）[16]，运输过程中温度的升高亦可增强反应。因此，Voyvodic等[34]设计了一款无细胞传感器可以100%准确区分哪些饮料中含有苯甲酸盐。内分泌干扰素是一类能扰乱生殖系统的化学物质。Salehi等[24]设计了基于转录因子甲状腺受体识别的无细胞生物传感器，用于检测内分泌干扰素。基于细菌检测内分泌干扰物需要24～36 h，而该生物传感器只需要不到30 min就可以得到结果。此后，他们将甲状腺受体结合域替换为雌激素受体结合域设计生物传感器检测血液与尿液中的内分泌干扰素双酚A、β-雌二醇与二乙基丙腈[25]，检测限分别为330、26 nmol/L和9 nmol/L，比同类细胞生物传感器检测效果更好。缺乏氨基酸会导致生理功能异常，影响抗体代谢，因此氨基酸可作为多种癌症早期诊断的指标。Jang等[37]报道了无细胞生物传感器检测氨基酸。此后，Jang等[52]又对其进行改进，与血糖仪结合使用，使其操作更方便。生物标志物是可标记细胞、组织器官等的结构或功能发生改变或可能发生改变的生化指标。Takahashi等[41]设计的低成本纸张无细胞生物传感器检测临床粪便样本中的生物标志物mRNA，检测限为30 amol/L～3 fmol/L。无细胞生物传感器不仅可用于物质检测，也可作为教学工具辅助生物学习，Huang等[35]设计了检测香蕉和猕猴桃DNA的教学工具，便于学生对生物学的理解。

3 结 语

综上，无细胞生物传感器的研究日渐增多，其发展也越来越成熟。目前，多种平台已用于构建无细胞生物传感器，平台覆盖了溶液、纸张、电极、纳米载体、微流体。无细胞生物传感器已在水样、血清、尿液等实际样品中应用，但对于食品等复杂实际样品检测的应用还比较少，这或许是后续工作可以重点关注的领域。

随着样品检测需求日益增加，无细胞生物传感器依然面临巨大的挑战：1）实际样品的复杂性，含有多种成分会干扰无细胞生物传感器的检测。为提升无细胞生物传感器检测的准确性，可寻找新的识别元件或设计更为高效的开关或优化无细胞体系等有效的措施提升无细胞生物传感器的灵敏度和特异性；2）目前用于无细胞系统的主要是大肠杆菌提取物，未来可以基于真核生物的提取物设计灵敏度更高、更为实用的生物传感器；3）实际样品检测单一，无细胞生物传感器目前大多数还是检测水样和血清，对于多样化实际样本的检测是未来的检测应用方向；4）目前基于无细胞生物传感器的研究方向比较单一，多集中于液相平台和使用转录因子识别，因此研究多样化识别元件和平台是未来发展趋势。综上所述，无细胞生物传感器展现出了极大的检测应用潜力，随着进一步的研究开发，便携、灵敏的无细胞生物传感器有望在医学、食品、环境等领域中投入应用。