姜黄素与蛋白质相互作用研究进展

甘传发，郭金英，白周亚

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

姜黄素是从姜科、天南星科等植物的根茎中提取的一种多酚类物质，是植物界很稀少的具有二酮的酮类化合物[1]。姜黄素是世界上销量最大的天然食用色素之一，是世界卫生组织和美国食品药品管理局等准许使用的食品添加剂[2]。姜黄素不仅是一种非甾体类抗炎药物，而且对疾病具有广泛的预防特性[3]。

现代医学研究发现人体众多疾病的发生与自由基形成、炎症反应的参与有关，姜黄素抗氧化活性和抗炎作用已引起国内外学者的广泛关注[4]。姜黄素还具备抗氧化、抗凝血、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗肝纤维化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等生物活性，且毒性低，广泛应用于食品加工与医疗行业[5-6]。研究表明,姜黄素作为一种食品添加剂，具有多种药理活性和生物活性，而且姜黄素的毒副作用小，功能多样且强大，这些都表明姜黄素在未来的应用前景非常广阔[7]。但姜黄素水溶性差，在体外易被氧化，且溶解度低、代谢快，导致生物利用度低，限制了姜黄素的深入利用[8]。

多酚类物质与蛋白质的相互作用是小分子化合物与生物大分子相互作用领域中研究的热点。本文介绍了姜黄素与蛋白质相互作用对姜黄素理化性质的影响，探讨了姜黄素与蛋白质相互作用机理及影响因素，分析了姜黄素与蛋白质相互作用的分析技术，以期为姜黄素和蛋白质相互作用研究提供理论依据和方法，为姜黄素的利用提供参考。

1 姜黄素与蛋白质相互作用对姜黄素理化性质的影响

姜黄素是一种具备多种生物活性，且极有利用价值的脂溶性多酚，但遇光容易分解，不耐热，溶出速率慢，在肠道的碱性环境中不稳定，难以被机体吸收利用，从而限制了姜黄素的生物利用度[9]，进而极大限制了姜黄素在食品工业中的应用及活性功能的体内发挥[10]。攻克姜黄素理化性质的缺点、充分利用姜黄素的生物活性成为现阶段研究的热点。

由于姜黄素溶解度较低、溶出速率慢,极大限制了其药理作用，提高姜黄素的溶解度就可能提升其生物利用率，从而最大程度发挥姜黄素的生物活性。Moghadam等[11]研究发现姜黄素与核桃蛋白形成络合物后，不仅对核桃蛋白的化学结构没有明显影响，而且改善了姜黄素的溶解度，这是因为核桃蛋白分子包封姜黄素分子使其溶出速率变快，可以更好地利用姜黄素的抗氧化活性。这与Vijayan等[12]的研究相似，他们利用豌豆分离蛋白和乳清分离蛋白复配后再与姜黄素络合，形成的络合物不仅能更好地保护姜黄素，而且解决了姜黄素水溶性差和生物可及性有限的问题，使得姜黄素具有较好的溶解度。同样有研究表明姜黄素能与大豆分离蛋白通过疏水作用络合形成稳定的复合物，使姜黄素的水溶性增加，同时会提高其在胃液和肠液中的稳定性，为肠道吸收提供足够的时间，大大提高了姜黄素的生物利用率[13]。这一结果说明姜黄素的稳定性同样能影响其生物活性的发挥，正如Okagu等[14]利用姜黄素与琥珀酰化蛋白络合形成稳定的复合物，结果表明反应形成的复合物能保护姜黄素，增强了姜黄素在胃期间的稳定性，使其有充足的时间被吸收利用[15]。这一结果同样也被Wang等[16]发现，姜黄素与蛋清分离蛋白形成的复合物在一定程度上可以保持姜黄素的稳定性，保护姜黄素不被热降解，进而提高姜黄素的保留率。出现这种情况可能是因为姜黄素与蛋白质结合后导致蛋白质的非极性基团暴露而诱导蛋白质变性，使复合物更加稳定[17]，这样更有利于姜黄素的充分利用。这也说明温度能影响姜黄素和蛋白质相互作用，从而改善姜黄素的稳定性和溶解度，进而提高生物利用率。此外，研究表明蛋白质的结构同样可以改进姜黄素的稳定性和溶解性。Solghi等[18]将姜黄素包封在乳清蛋白分离物中，形成稳定的球形复合物，能将姜黄素的氧化稳定性从10%提高到70%，这是提高姜黄素生物利用度的有效途径[19]，使得姜黄素的生物活性得到最大的运用。这是因为球形的复合物可以使其接触面积更大，有益于它的溶解，而球形具有更稳定的结构，可以提升稳定性。这与Cai等[20]的研究非常相似，他们制备了太子参蛋白-姜黄素纳米复合物，因所制得的复合物具有均匀的球形结构，使得复合物拥有良好的稳定性，不但改进了姜黄素的稳定性和抗氧化性，而且有助于细胞吸收。总的来说，蛋白质可以与姜黄素相互作用而改善其溶解度、稳定性以及生物可及性，而外部环境也会影响两者相互作用，如温度、蛋白质结构等。

2 姜黄素与蛋白质相互作用机理及影响因素

2.1 姜黄素与蛋白质相互作用机理

姜黄素与蛋白质的相互作用主要是通过氢键、疏水作用力、范德华力、静电引力等非共价键作用发生的可逆性结合，在结合过程中往往会伴随对蛋白固有荧光的猝灭机理。氢键和疏水作用力是姜黄素与蛋白质之间的主要作用力，而范德华力和静电引力次之。Ying等[21]研究发现姜黄素与胃蛋白酶之间会相互作用，导致胃蛋白酶荧光产生静态猝灭机制，而热力学参数表明除氢键外，疏水作用在稳定姜黄素-胃蛋白酶复合物中也起着重要作用。相似的结果也被Yi等发现，他们利用荧光实验证实了姜黄素与乳清分离蛋白-海藻酸钠复合物之间的自发相互作用主要是由疏水作用和氢键引起的。除此之外，姜黄素与蛋白质间可能会有其他作用力，如范德华力、静电引力等。陈宁生等[22]用光谱法研究姜黄素与牛血清白蛋白的作用机理，先测定出两者的结合常数，再由结合反应的焓变和熵变推测范德华力和氢键是主要的内在结合力。路东亮等[23]也证实了姜黄素与牛血清白蛋白主要以氢键和范德华力相结合，同样也造成蛋白荧光的静态猝灭。目前研究发现，尽管研究材料相同，但如果改变了反应体系的环境，会发现姜黄素与蛋白质间相互作用机理不同。张晓星等[24]在碱性条件下通过反应前后热力学变化分析姜黄素与牛血清白蛋白的作用机理，得出反应体系中主要作用力是静电引力。赵悦等[25]通过多种荧光光谱结合电化学法，发现姜黄素与牛血清白蛋白的相互作用是自发的疏水作用。这些结果表明，不同的蛋白质与姜黄素之间作用机理不尽相同，相同蛋白也会因不同环境和不同研究方式而呈现出新的作用机理。随着科学技术的发展，越来越多的分析技术用于研究姜黄素与蛋白质相互作用，会发现更多作用机理。

2.2 影响因素

目前对影响姜黄素与蛋白质相互作用的主要因素的研究主要包括反应体系浓度比[26]、温度[27]、pH[28]、蛋白质结构和动能[29]、超声[30]等。不同浓度比会产生不同的效应，王晶晶等[31]研究姜黄素与猪脂肪氧化酶相互作用对蛋白质结构的影响，结果表明，姜黄素浓度越高，对脂肪氧化酶的抑制作用越强，反之则抑制作用越弱。类似的结果被Zhan等[32]发现，通过亲水性乳清蛋白分离物与疏水性玉米蛋白制备蛋白基复合纳米颗粒包封姜黄素，当改变两种蛋白的质量比时，姜黄素的溶解度也随之改变。这些结果表明，反应体系中浓度比对两者相互作用影响较大，同样，反应体系的物质状态也会影响姜黄素与蛋白质相互作用，Ye等[33]证实了通过喷雾干燥后，姜黄素-乳清蛋白分离物的络合被增强，使得干燥后未结合的姜黄素含量降低，比原液具有更好的水溶性、稳定性和生物可及性，进而提高了生物利用率。反应体系的环境同样会影响两者之间的相互作用，而最为典型的环境变化就是体系中pH值的变化。Wang等[34]以猪血浆蛋白为载体通过pH漂移法提高姜黄素的稳定性和分散性，而随着最终pH值的增加，姜黄素-猪血浆蛋白复合物的稳定性提高，且结合复合物的抗氧化性与天然姜黄素相当。不同蛋白质会呈现不同的结构与功能，它们与姜黄素的相互作用也会不同，Peng等[35]分别利用乳清蛋白、大豆蛋白对姜黄素纳米颗粒进行包覆，得出不同的最大承载能力，表明蛋白质结构与功能的不同会造成两者相互作用的强弱不同。

3 姜黄素与蛋白质相互作用的分析技术

姜黄素与蛋白质结合方式可通过测定二者的结合常数和结合位点数、作用力类型，分析结合前后蛋白构象的变化等方式进行表征。除了紫外可见吸收光谱、荧光光谱、傅里叶红外光谱等常规方法外，近年来圆二色性光谱法、量热法、分子对接模拟、分子动力学等新方法正逐渐应用于分析姜黄素与蛋白质的相互作用。

3.1 紫外可见吸收光谱

紫外可见吸收光谱仪具有应用广泛、成本低、操作简便快速、准确度高、灵敏度高的特点。紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱，可用于探索蛋白质的结构变化和研究蛋白质小分子复合物的形成[36]。

张秋兰等[37]运用紫外可见光谱结合计量学研究姜黄素与人血清白蛋白的相互作用，表明姜黄素可以通过π-π堆积吸附在人血清白蛋白的表面而形成复合物。Zhang等[38]通过紫外可见光谱证实了姜黄素-肌球蛋白复合物的存在，并结合稳态荧光光谱研究结果显示姜黄素与肌球蛋白的结合具有静态猝灭作用。

3.2 荧光光谱

蛋白固有荧光归因于色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)，可以用于阐明配体与蛋白的相互作用后蛋白的猝灭机制和构象变化。荧光光谱是被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光经放大后输出的发射光谱，其中稳态荧光光谱表明蛋白的猝灭机制，而同步荧光光谱则反映蛋白的构象变化[39]。荧光光谱可以分析多种元素，包括固体、粉末、熔珠、液体等样品，同时它还具有灵敏度高、分析速度快、测量范围宽、干扰小等优点，但不宜用于测定荧光持续时间较短的物质，且荧光发散不集中，强度不高。

Jahanshahtalab等[40]利用稳态荧光光谱分析α-乳清蛋白与白藜芦醇和姜黄素的相互作用，表明α-乳清蛋白的荧光是以静态机制进行猝灭的，两种多酚共同作用猝灭效果更佳；并通过同步荧光光谱分析表明α-乳清蛋白的构象发生了改变。林坚涛等[41]也通过稳态荧光光谱研究发现姜黄素与牛血清白蛋白的相互作用致使蛋白荧光发生静态猝灭。方瑞萍等[42]研究发现，随着姜黄素浓度的增大，牛血清白蛋白中色氨酸残基和酪氨酸残基均表现出一定的荧光猝灭作用，色氨酸残基猝灭较明显。这是因为姜黄素的加入改变了色氨酸所处的微环境，使其极性减小，疏水性增加，改变了牛血清白蛋白的内部构象。荧光光谱除了包含稳态荧光光谱和同步荧光光谱外，同时还有三维荧光光谱。现阶段在对多酚与蛋白质的相互作用的研究中，三维荧光光谱技术在荧光分析时得到了越来越多的应用，因其可以提供更详细的多酚与蛋白质相互作用时构象变化的信息[43]。

3.3 傅里叶变换红外光谱

傅里叶变换红外光谱是通过测量干涉图和对干涉图进行傅里叶变化的方法来测定红外光谱。在蛋白质结构分析的常用方法中，红外光谱有其突出的优点，它适用于不同状态、不同浓度及不同环境中蛋白质和多肽的测定。

傅里叶变换红外光谱往往都是与荧光光谱配合使用，共同说明蛋白质-配体复合物的形成，Razzak等[44]的荧光实验表明，随着姜黄素浓度的增加，蚕蛋白的固有荧光逐渐被猝灭，说明姜黄素分子与蛋白质中荧光团氨基酸残基(Tyr和Trp)进行了分子络合。结合傅里叶变换红外光谱分析表明，姜黄素与蚕蛋白是通过特定的氨基酸残基形成络合物，从而有效抑制姜黄素的降解，使姜黄素的抗氧化活性提高30%。最终表明蚕蛋白可用于递送水不溶性生物活性药物。

3.4 圆二色性光谱

圆二色性光谱是以摩尔椭圆度或吸光率之差为纵坐标、波长为横坐标所制作的曲线，可用于观测蛋白质的二级结构变化，常被用于表征多酚与蛋白质相互作用，并估算蛋白的二级结构含量变化，如α-螺旋、β-折叠、γ-转角和无规则卷曲[45]。圆二色性光谱仪具有样品耗量少且数据处理量小等特征，它常常与其他技术联用来研究小分子与蛋白质结合过程中的结构变化，如同步、三维荧光。

Mohammadi等[46]用圆二色性光谱研究姜黄素与人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的结合。根据圆二色性光谱的微小变化计算出供体(HSA和BSA)二级结构含量发生部分变化，而这两种白蛋白的二级结构的微小变化表明配体诱导的构象变化只局限在结合位点上，并不涉及蛋白质折叠的显著变化。邓楚君等[47]利用圆二色性光谱分析天然和热变性乳铁蛋白与姜黄素的复合物，发现乳铁蛋白的二级结构发生了不可逆的改变，说明姜黄素的添加能够显著改变乳铁蛋白的二级结构。

3.5 量热法

量热法具有灵敏度高、重复性好的优点，可一次性测定多个结合参数，受沉淀影响小，但也有加热效应弱、测试耗时等缺点。目前用于研究多酚与蛋白质相互作用的量热法是差示扫描量热法和等温滴定量热法。差示扫描量热法是测量输入到试样和参比物的功率差与温度的关系，而等温滴定量热法主要用于检测多酚与蛋白质相互作用过程中完整的热力学参数，如结合亲和力、熵、焓、比热容以及动力学的信息等[48]。最终利用热力学参数得出作用力类型。

刘宇佳[49]将差示扫描量热和X射线衍射实验联用，发现姜黄素和卵清蛋白形成的复合体系中姜黄素的晶体结构消失，蛋白更容易受到热分解作用，但复合体系改善了姜黄素的溶解度，提高了约370倍，表现出更好的抗氧化活性和光稳定性。研究表明，等温滴定量热法相比差示扫描量热法更精确、更广泛，现阶段研究多酚与蛋白质相互作用更多的是通过等温滴定量热法，如Wang等[50]利用等温滴定量热法并结合稳态荧光光谱得出结合常数、结合位点数以及焓变和熵变，最后通过计算得出鳕鱼蛋白与姜黄素的结合主要受疏水相互作用驱动，导致静态荧光猝灭和能量释放。

3.6 分子对接

分子对接模拟已成为研究分子间相互作用的重要手段之一，该技术是一种基于生物信息学的分析方法，其原理基于“锁钥模型”和“诱导契合学说”原理[51]，通过计算机软件，建立小分子配体与蛋白质受体结构，模拟二者结合的分子行为与结构变化。分子对接技术分为三类：刚性对接、半柔性对接、柔性对接。其中半柔性对接通常用于研究小分子与蛋白质的相互作用，半柔性对接允许对接过程中小分子构象发生一定程度的变化，但通常会固定大分子的构象，这会使小分子构象的调整也可能受到一定程度的限制。

分子对接技术通常与光谱学、量热法联用，用于验证光谱实验或量热实验的结果。Ying等采用多光谱法和分子对接技术研究在胃的生理pH值下，姜黄素可以通过联合猝灭过程有效地猝灭胃蛋白酶的荧光。荧光实验表明两者的结合主要通过疏水作用力，而圆二色性光谱和紫外可见吸收光谱研究表明，两者的结合导致胃蛋白酶构象变化，最后通过分子对接验证光谱实验结果，并揭示姜黄素还可能与胃蛋白酶形成氢键，进一步稳定了姜黄素-胃蛋白酶复合物。类似的研究结果被Mehranfar等[52]揭示，荧光实验研究表明姜黄素在酪蛋白分子上存在一个单独的结合位点，具有较高的亲和力，而且酪蛋白的荧光猝灭可能是静态猝灭机制。分子对接研究结果表明，姜黄素可能在疏水核心与酪蛋白结合，并进一步验证荧光实验结果。

3.7 分子动力学

分子动力学主要是依靠牛顿力学来模拟分子体系的运动，在由分子体系的不同状态构成的系统中抽取样本，从而计算体系的构型积分，并以构型积分的结果为基础进一步计算体系的热力学量和其他宏观性质[53]。

通常将分子动力学与光谱学或者分子对接结合使用。Zhang等基于光谱技术研究姜黄素与肌球蛋白相互作用的分子动力学模拟，通过分子动力学观察并结合圆二色性光谱研究表明，姜黄素与肌球蛋白的相互作用使蛋白的二级结构发生了轻微的变化。而且通过分子动力学模拟技术观察到疏水作用和氢键促进了姜黄素-肌球蛋白复合物的形成。张天一等[54]则是运用分子对接和分子动力学模拟的方式，对姜黄素与高危型人乳头瘤病毒的E6蛋白相互结合模式研究发现E6蛋白与姜黄素可以通过疏水作用特异性结合而形成复合物。

姜黄素与蛋白质的相互作用复杂，需要多种研究方法的结合使用。光谱学、量热学、分子模拟等的发展，为我们研究姜黄素与蛋白质相互作用提供了有力的技术保障。除此之外，研究多酚与蛋白质相互作用的方法还有很多，如高效液相色谱、核磁共振波谱、拉曼光谱等，但这些方法是否可以用于研究姜黄素与蛋白质相互作用中还有待探讨。

4 结论与展望

目前研究表明，对于研究姜黄素与蛋白质相互作用来改善姜黄素水溶性差、代谢快、热稳定性差等理化性质造成其生物利用率较低方面取得了一定的成效，但两者间相互作用的具体机制尚不明确。另外，分子间相互作用会受到诸多因素的影响，不仅要注意反应体系环境中的影响因素，更要考虑在机体消化环境下姜黄素与蛋白质、消化酶之间存在的各种竞争相互作用关系，而这种竞争相互作用关系是否会影响机体消化吸收及姜黄素生物活性尚不清楚。此外，虽然姜黄素与蛋白质之间相互作用的分析技术较多，但往往只是选择部分技术用于研究，所以建立稳定可靠的研究方式是必然趋势。

因此，今后的研究方向可以从以下两个方面进行探讨：一方面，可以借助更多的分析技术方法，如生物信息学、分子生物学等技术，采用多种分析技术联用的方法研究姜黄素与蛋白质之间的相互作用，更全面地揭示两者间交互作用机制，为进一步阐明姜黄素的生物活性机制提供基础。另一方面，研究人员进一步研究姜黄素在机体内与不同蛋白的结合特性，进而明确机体内各种蛋白与姜黄素的交互作用机制，从而为改善姜黄素生物利用率和生物活性的表达提供理论条件。