塞内卡病毒诊断技术研究进展

雷乾 ，刘娜，赵俊芳，孙鹏 ，卢曾军，李志勇

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056021；2.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室 国家口蹄疫参考实验室，甘肃 兰州 730046；3.温州医科大学，浙江 温州 325035）

塞内卡病毒A 型是导致猪传染性猪塞内卡病毒病的主要病原，该病毒于2015 年在不改变病毒名称的情况下由国际病毒分类委员会（ICTV）允许将种名称由“Seneca valley virus”改为“Seneca virus A”。SVA 病毒是2002 年首次在美国的一家公司进行腺病毒培养的人视网膜母细胞上偶然发现的一种病毒，并猜想其可能来源于猪胰蛋白酶体或胎牛血清中，且在2005 年确定了第一个完整的基因组序列。塞内卡病毒A（Seneca virus A，SVA）为单股、正链、无囊膜的小核糖核酸病毒科，是塞内卡病毒属唯一代表性的病毒株，最近研究发现该病毒是与心脏病毒属成员密切相关的单链RNA 病毒，是一种能在人的癌细胞中复制的一种溶瘤性微小RNA 病毒，因此目前有研究将SVA 作为一种溶瘤病毒用于治疗某些人类神经内分泌肿瘤。

2002～2013 年期间，SVA 在美国和加拿大呈散状发生；在2007 年的美国部分区域一些猪的口鼻和蹄冠部出现水泡、溃疡等症状，经过实验室检测判定为SVA 阳性，养殖行业的人们这才开始关注SVA 病毒带来的危害；2014 年巴西有大量的SVA 病例发生，由该病毒引起新生仔猪死亡率在30%～70%，从那以后这种疾病在养猪业中逐渐受到重视；同年11 月，北美地区暴发SVA 疫情的数目逐渐增多，广东省首次于2015年5 月出现SVA 引起的猪水疱病，并开始扩散，湖北省在2016 年开始涌现散发个案，2016 年12 月份黑龙江分离到塞内卡毒株。截至2019 年12 月，在广东、河南、湖北、黑龙江等地已经报道了由SVA 引起的猪水泡病疫情，且SVA 毒株在不停的变异。SVA 临床症状和口蹄疫病症十分相似难以区分，对仔猪的危害性较大并给畜牧业带来巨大的财产损失。本文对塞内卡病毒临床特征和检测技术进行综述，以期为SVA 病毒检测防控提供技术参考。

1 临床特征

SVA 感染猪后，育肥猪、经产母猪和公猪在鼻腔和口腔有溃疡，鼻部和冠状动脉束带上有红色聚集性侵蚀和破裂的小泡，偶见发烧跛行及腹泻，仔猪在出生后的第一周表现出肌肉无力、嗜睡、流涎过多、皮肤充血、消瘦，神经系统表现和腹泻等临床症状；一些仔猪发生急性死亡。临床症状持续3～10 天，然后在存活的仔猪中消失。

2 塞内卡诊断技术

2.1 SVA 病毒的分离与鉴定

分离病毒时采集的样品组织应为病变明显的部位，SVA 病毒应采集食道和眼部的分泌物，颌下淋巴结，水泡液及水泡皮去进行体外的分离培养，用于SVA 培养的细胞系包括人胚胎视网膜细胞（PER-C6），猪睾丸细胞（ST）等，病毒诱导的细胞病变作用（CPE）可作为病毒感染的直接指标，而SVA 的CPE 需要较长的时间，并且必须具备相关的知识积累和实验技能才能作出判断，所以SVA 病毒在细胞上的分离鉴定来确诊不是便捷有效的方法。

2.2 SVA 病毒的原位杂交和免疫组化

SVA 诊断可以通过原位杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）检测组织中的抗原或核酸来实现，也可用于检测组织样本中的病原体可以显示病原微生物在组织细胞内的定位与分布。原位杂交技术最早由Pardue 和Gall、John 于1969年建立，它的原理是利用核酸的特性（即它们彼此特异性退火形成杂合体的能力）在细胞内鉴定特定序列，将这些特定序列的DNA 或RNA 定位到特定细胞或染色体位点。Resende 等，在2017 开发了一种新的原位杂交技术——RNAscope （ISH）来检测感染组织中的SVA 的RNA，通过靶向VP1 基因区域的特定RNA 探针来确认水疱病变中的病毒，并表现出高水平的特异性。这种新颖的原位杂交平台将SVA 和组织学病变联系起来，补充了qRT-PCR 作为一种诊断技术来研究潜在的新兴病原体。Leme 等人对死后不久的仔猪进行常规尸检，组织通过浸入10% 缓冲福尔马林溶液中进行固定，并进行组织病理学评估，选择来自口腔囊泡和皮肤损伤的组织切片用于免疫组织化学（IHC）测定，该测定采用单克隆抗体技术和逆转录PCR 测定出腹泻仔猪小肠中的SVA，证明了SVA 在肠上皮细胞内复制的能力。

原位杂交技术的缺点是难以识别具有低DNA 和RNA 拷贝的靶标，虽然免疫组织化学可以通过检测与组织学病变相关的抗原来克服这一问题，但它需要特定的抗体，而这些抗体获取需要一定难度并且特异性和敏感性较差。

2.3 分子生物学诊断

2.3.1 PCR

这项名为聚合酶链反应即PCR 技术，能在短时间内高效地扩增基因或特定核酸序列，广泛应用于传染病、肿瘤、法医学、寄生虫病、动物和考古学等领域的诊断和研究，PCR 法检测SVA病毒也是一种实验室常用的方法。Leme 等设计了一套引物以在RT-PCR 测定中扩增塞内卡病毒基因组VP3/VP1 区域的542 bp 产物大小；范慧等在分析了SVA 的基因组后在5’UTR 和3D基因区域设计了三对PCR 引物并筛选出最合适引物对，通过优化扩增体系和条件最终建立了RT-PCR 检测方法。

2.3.2 实时荧光定量PCR

荧光定量PCR 是在聚合酶链式反应体系中加入荧光报告基团，在PCR 反应的每个周期通过收集荧光信号的产生来进行监测。因此，出色的灵敏度和特异性、可重复的数据、低污染风险和减少的手动操作时间（无需进行PCR 后分析）相结合，使实时荧光PCR 技术成为传统PCR 的有力的替代品。林彦星等依据SVA 病毒上3D基因序列在软件中设计最佳引物和探针，创建了检测SVA 的实时荧光RT-PCR 法，该方法可检测较低的敏感性；重复性好。陈鑫等根据对国内18 株塞内卡病毒的序列比对分析结果，在SVA的5’UTR 区域设计并合成一对特异性引物和Taqman 探针，采用Taqman 实时荧光定量PCR技术通过优化反应条件，建立定量检测SVA 的方法。

2.3.3 数字PCR

微滴式数字PCR（ddPCR）是按照将含有核酸分子的反应体系等分到大量独立的反应单元去进行扩增，目的核酸分子的绝对定量分析是根据阳性比例和泊松分布原理去计算的。数字PCR 消耗品成本较低，不存在已知浓度的参考物质，与实时PCR 相比，在低浓度下目标定量的精确度以及对不同类型样品的抑制剂的高抗性，ddPCR 在油相中产生液滴，可以避免液滴之间的非特异性扩增和交叉污染。除了用作诊断工具外，RT-ddPCR 还用于评估本项目的生物样本，以便在不需要标准曲线的情况下提供SVA RNA 的绝对定量。Oliveira 等研究表明ddRTPCR 在测试猪血清时，其性能优于RT-PCR，单步RT-ddPCR 和RT-qPCR。ddRT-PCR 用作SVA 的辅助诊断工具和生物样品中病毒RNA的绝对定量，是水疱疾病控制计划的有效工具。张洲等建立了一种检测SVA 病毒3D 基因的逆转录微滴数字PCR （RT-ddPCR）的方法，该检测方法的灵敏度比逆转录实时PCR 检测方法高约10 倍，特异性实验表明与其他猪水疱病病原体无任何交叉反应。

2.3.4 巢式PCR

巢式PCR 是指先后利用2 套PCR 引物进行扩增的PCR 技术。Feronato 等设计了两对引物对SVA 的VP1 基因组片段进行扩增。在对18头的猪群进行RT-PCR 和巢式PCR 检测时阳性率分别为11 头（61.1%）和16 头（88.9%）结果表明，与常规的RT-PCR 相比，巢式PCR 是巢式PCR 是一种灵敏、高效、简单、经济的诊断方法；因此，巢式PCR 可以用作一种有效的诊断工具。

2.4 血清学检测方法

2.4.1 病毒中和试验

病毒中和试验 （Virus Neutralization Assay）是一种血清学试验，用于检测阻止病毒传染性的功能性全身抗体的存在和数量，是病毒学的经典方法之一。VNT 检测是一种高度敏感和特异的检测方法，该方法是基于在血清中存在中和抗体的情况下抑制细胞培养中的病毒感染性。作为SVA 感染的诊断，常规VNT 的特异性和敏感性均略高于竞争性ELISA。刘福晓等使用反向遗传学构建了重组SVA CH-LX-01-2016，并被证明能够在体外有效表达增强的绿色荧光蛋白（eGFP），这种荧光的跟踪特性极大地促进了病毒中和试验（VNT）的检测效果。在此研究中，这种新方法比使用传统方法更敏感和特异性，因为病毒中和实验的最终结果将取决于绿色荧光蛋白，这种新型VNT 可广泛用于临床诊断。

2.4.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

通过使用酶标记的偶联物和酶底物获得的颜色变化来显示抗原-抗体反应并用于识别生物体液中分子的存在和浓度的定量分析方法通常被称为酶联免疫吸附试验（ELISA），主要包括液相阻断ELISA、固相竞争ELISA、间接ELISA等，可按照不同的检测要求去进行选择；孙培培等利用塞内卡的重组VP2 蛋白及其相应的辣根过氧化酶（HRP）标记的单克隆抗体，建立了检测SVA 抗体的阻断ELISA 方法；柴茂等建立基于VP2 蛋白、VP3 蛋白检测猪塞内卡病毒A 抗体间接ELISA 方法；Goolia 等开发了竞争性酶联免疫吸附测定（eELISA）作为SVA 抗体的筛选，这些试验都可适用于检测猪SVA 的临床诊断。

3 其他新型检测技术

3.1 逆转录环介导等温扩增技术

基于核酸的技术被认为是遗传学诊断中最准确的工具。环介导等温扩增（LAMP）技术就是其中之一，近年来得到了广泛的应用。该方法的优点在于快速、高效、灵敏、经济，它在等温条件下工作，并使用具有链置换活性的DNA 聚合酶扩增目标基因。迄今为止，该方法已广泛应用于病原体检测、作物生长发育和疾病诊断等不同研究领域。

田瑶等针对SVA 高度保守区域，设计了5对特异性LAMP 引物，并通过反应条件优化、敏感性试验、特异性试验以及临床样本检测，建立了一种新型塞内卡病毒LAMP 可视化快速检测方法，曾凡文等特异性扩增了SVA 的VP1 和VP2 区域用于开发实时RT-LAMP 的方法,该实验证明实时RT-LAMP 比实时RT-PCR 的结果更优越。

3.2 RPA

重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种高灵敏度和选择性的等温扩增技术，在37℃～42℃条件下工作，样品制备要求低，能够在不到20 分钟的时间内扩增低至1～10 个DNA 靶标。它已被用于扩增来自各种生物体和样品的各种靶标，包括RNA，miRNA，ssDNA 和dsDNA。此外，RPA 可以与不同的检测策略结合，从侧流层析试纸条到实时荧光检测等。王慧宝等开发了一种简单、快速和准确的诊断方法，结合重组酶聚合酶扩增和侧向流动试纸条 （RPA-LF）来检测SVA 感染，结果可直接在试纸条上观察到。林彦星等建立了一种荧光RT- RPA 快速检测法具有特异性强，简便快速，重复性好，灵敏度高，比实时荧光RTPCR 法灵敏度低两个数量级的特点。

4 讨论与展望

SVA 的天然宿主是猪且与猪的水疱病紧密相关，对仔猪的危害较大给养殖业造成巨大的经济损失，临床上的病症无法和口蹄疫区分开来，需要立即去进行排除诊断，中国的SVA 病例在多省份零星发生。随着科学技术的发展，SVA 的诊断技术已经日益成熟，朝着更快速、准确、便捷的方面发展。目前已经开发了各种诊断方法，从病毒分离实验到竞争性和封闭抗原的ELISA 等常规方法到RT-PCR 和RT-LAMP 等基于分子的方法。尽管基于ELISA 的方法具有良好的诊断灵敏度和特异性，但分子检测方法的优势在于检测最小病毒RNA 具有更高的分析灵敏度。尽管有这些准确和可靠的SVA 检测方法，研究人员一直在开发替代方法，以尝试克服一些实际挑战，例如繁琐的程序和配备训练有素的现场人员的设备齐全的实验室环境，开发了横向流动装置并将便携式RT-PCR、RT-LAMP 和RT-RPA 与LF 技术相结合，以提高SVA 检测的灵敏度。然而，这些检测从实验室到现场实际应用的转化仍然有限，需要解决各种技术和成本问题，以开发一种更灵活、更实惠的诊断工具，可广泛用于SVA 检测。