雪莲培养物对酒精性肝损伤及酒精代谢的影响研究

曹坦，李胜男，龙则河

（大连普瑞康生物技术有限公司，辽宁大连 116001）

菊科植物天山雪莲Saussurea involucrata(Kar.et Kir.)Sch.-Bip.为药食同源植物，药用记载始于藏医药著作《月王药珍》，具有温肾助阳，祛风去湿，痛经活血等功效，系维吾尔族习用药材[1]。在新疆等地区，雪莲泡酒食用十分常见。天山雪莲生长分布范围稀缺，生长环境特异，存在过度采挖、栽培困难等问题，野生资源濒临灭绝。1996年天山雪莲被列为国家二级濒危植物；2000 年国务院13 号文件明令禁止采挖野生雪莲。通过植物细胞培养技术获取天山雪莲细胞，解决了野生天山雪莲资源紧缺的问题。2010年，原卫生部批准雪莲培养物为新资源食品。雪莲培养物具有苯丙素类、黄酮类、木脂素类和甾体类等化学成分[2]，具有抗炎[3]、抗缺氧[4]、免疫调节[5]、降血脂[6]等药理作用。

酒精性肝损伤(alcoholic live disease,ALD)是指长期或大量饮用含有乙醇的饮料而引起的肝脏疾病[7]。在我国，酒精性肝病的发病率逐年上升，其危害仅次于病毒性肝炎。已有研究表明，天山雪莲乙醇提取物对缺氧小鼠肝脏线粒体具有保护作用[8]；对力竭性游泳过程中造成的小鼠肝、肾损伤有一定的保护作用[9]。未见雪莲培养物对酒精性肝损伤保护等的相关研究报道。

本研究探究雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠模型的肝功能的作用，分析雪莲酒和基酒灌胃后，小鼠体内酒精代谢情况，分析基酒和雪莲酒灌胃后，小鼠肝的相关指标变化，探讨雪莲培养物对急性酒精肝损伤、雪莲酒对酒精代谢速度及肝功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验一：雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠的影响

1.1.1 小鼠分组处理及样品制备

昆明小鼠，雌雄各半（4～6 周）。将昆明小鼠随机分为空白对照A 组、模型组、雪莲培养物高（28.57 mg/kg）、中（14.28 mg/kg）、低（7.14 mg/kg）剂量组及阳性药组（水飞蓟宾10 mg/kg）。每日经口灌胃给予受试样品，空白对照A 组和模型组给予蒸馏水（10 mL/kg）。每周称重两次，按体重调整受试样品剂量，给药时长为30 d。给予受试样品结束时将模型组及各样品组一次灌胃给予50 %乙醇12 mL/kg·BW，空白对照组A 给蒸馏水，禁食16 h，乙醚麻醉后，正中切口进腹，于下腔静脉穿刺，抽取血液标本，分离肝组织，用于各项指标的检测及病理组织学检查。

1.1.2 肝损伤相关指标测定

取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2 M 磷酸盐缓冲液，以20000 r/min 匀浆10 s，间歇30 s，反复进行3次，制成5 %组织匀浆(W/V)，3000 r/min 离心5～10 min，取上清液进行丙二醛(MDA)测定。取肝脏0.5 g 加生理盐水5 mL 充分研磨成细浆(10 %肝匀浆)，混匀后取浆液0.5 mL 加4 %磺基水杨酸0.5 mL 混匀，室温下3000 r/min 离心10 min，取上清液即为样品，进行还原型谷胱甘肽(GSH)测定。取肝脏0.1 g 加无水乙醇0.9 mL 冰水浴条件下机械匀浆(2500 r/min)，离心10 min，取上清液待测。参考试剂盒说明进行甘油三酯(TG)测定。

1.1.3 肝脏病理组织学变化及诊断标准

从肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，油红O 染色。从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40 倍物镜连续观察整个组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积。肝细胞内脂滴散在，稀少，记0 分；含脂滴的肝细胞不超过1/4，记1 分；含脂滴的肝细胞不超过1/2，记2 分；含脂滴的肝细胞不超过3/4，记3 分；肝组织几乎被脂滴代替，记4分。

1.2 实验二：小鼠体内酒精代谢检测

1.2.1 小鼠分组处理及样品制备

昆明小鼠，雄性，体重30～35 g。小鼠禁食不禁水12 h后，按下述剂量灌胃，饲养期间禁食不禁水。将小鼠随机分为空白对照B 组（蒸馏水10 mL/kg）、雪莲酒高（12 mL/kg）、中（8 mL/kg）、低（4 mL/kg）剂量A 组及基酒A 组（用量同上）。小鼠称重并记录。取健康小鼠，分别在灌胃30 min、1 h、6 h、12 h后，小鼠眼球取血，室温放置30 min，常温置离心机中3000 r/min 离心10 min。精密吸取上层血清100 μL 加入等量的二甲基亚砜，置SK-1 快速混匀器中混匀后，以15000 r/min 离心10 min。取上清液0.22 μm 有机系微孔滤膜滤过后测定，以保留时间定性，以峰面积定量。

表1 雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠肝脏中MDA、GSH、TG的影响(x±s)

1.2.2 标准曲线制备

称取无水乙醇2800 mg 于100 mL 量瓶，用50%二甲基亚砜水溶液稀释至刻度，作为乙醇母液，用经校正的微量移液器分别取5 mL、2.5 mL、1 mL、0.5 mL、0.2 mL、0.1 mL 乙醇母液置于20 mL量瓶，用50%二甲基亚砜水溶液稀释配制成不同浓度的乙醇标准溶液(7 mg/mL、3.5 mg/mL、1.4 mg/mL、0.7 mg/mL、0.28 mg/mL、0.14 mg/mL)。以乙醇浓度为横坐标，乙醇峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent HP-5 5 % phenyl methyl siloxane 30 m×320 μm×0.25 μm，进样口温度为240 ℃；FID 检测器温度为270 ℃；色谱升温程序：70 ℃(保留1 min)，5 ℃/ min 升至90 ℃(保留1 min)，40 ℃/min 升至270 ℃直到分析完成；载气：氮气流速为1 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为300 mL/min，分流比为20∶1。

1.3 长期饮酒后小鼠肝功能相关指标测定

昆明小鼠，雄性，体重30～35 g。将小鼠随机分为空白对照C 组（蒸馏水10 mL/kg）、雪莲酒B 组（中剂量8 mL/kg）、基酒组B（用量同上）。按上述剂量连续灌胃两个月，每天灌胃一次。相关指标含量测定按照“1.1 雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠的影响”方法测定。

2 结果与分析

2.1 雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠的影响

与空白对照A 组比较，模型组小鼠在制备急性酒精肝损伤模型后，肝脏中的MDA及TG含量显著升高，肝脏中的GSH 含量显著降低，表示肝损伤建模成功，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组小鼠相比，雪莲培养物低、中剂量组小鼠肝脏中MDA 显著降低，具有统计学差异(P＜0.05)；与模型组小鼠比较，雪莲培养物低、中、高剂量组小鼠肝脏GSH 显著提高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组小鼠相比，雪莲培养物低、中剂量组小鼠肝脏中TG显著降低，具有统计学差异(P＜0.05)。

小鼠肝脏病理组织学观察，空白对照A 组的小鼠肝组织结构完好，脂滴少；模型组小鼠可见明显的脂肪变性，出现大量脂肪空泡，提示酒精肝损伤建模成功。与模型组相比，雪莲培养物各剂量组出现不同程度的脂滴减少，肝组织结构趋向正常，见图1。

图1 小鼠肝脏切片的病理组织学观察（油红O染色）

小鼠肝组织脂肪变性程度积分，与空白对照A组比较，模型组小鼠在制备急性酒精肝损伤模型后，肝脏变性程度显著升高，具有统计学差异(P＜0.05)；与模型组小鼠相比，雪莲培养物低、中、高剂量组小鼠肝脏变性程度显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 小鼠体内酒精代谢情况

实验结果表明，基酒A 组与雪莲酒A 组小鼠血清中乙醇浓度均与灌胃剂量成正比。经不同时间采血测定血液乙醇含量，与基酒A 组比较，相应剂量的雪莲酒A 组小鼠血液中乙醇含量均降低，尤其在30 min、60 min，雪莲酒A 组小鼠血液酒精含量明显低于基酒A组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。基酒A 组与雪莲酒A 组小鼠血清中乙醇浓度均与灌胃剂量成正比。与基酒A 组小鼠比较，各个时间点相应剂量的雪莲酒A 组小鼠血液中乙醇含量均降低。以上结果说明，与基酒比较，雪莲酒一定程度上促进了小鼠血液的酒精代谢速度。

表2 雪莲培养物对急性酒精肝损伤小鼠肝脏病理组织变化的影响

表3 雪莲酒与基酒灌胃小鼠血清中乙醇含量的变化(x±s) (g/L)

2.3 长期饮酒对小鼠肝功能的影响

与空白对照C 组比较，经雪莲酒和基酒分别灌胃一个月后，小鼠肝脏MDA、TG 含量均有一定上升趋势，但无统计学意义；基酒降低了GSH 含量，雪莲酒无作用；雪莲酒和基酒分别灌胃两个月后，与空白对照C 组比较，基酒B 组MDA、TG 含量明显升高，雪莲酒无统计学差异；基酒和雪莲酒不同程度降低了GSH 含量，雪莲酒对GSH 降低程度更小。实验结果说明与基酒相比，雪莲酒对肝脏损伤程度较小。

3 结论

对小鼠进行不同干预后，与模型组比较，雪莲低、中剂量组急性酒精肝损伤小鼠肝脏MDA 含量显著降低；经GSH 活性检测，与模型组比较，雪莲低、中、高剂量组的小鼠肝脏GSH 含量显著提高；以甘油三酯测定试剂盒测定急性酒精肝损伤小鼠肝匀浆中的TG 活性，与模型组比较，雪莲低、中剂量组的小鼠肝脏TG含量显著降低。经油红染色观察肝脏病理组织学变化，与模型组比较，雪莲组低、中、高剂量组小鼠肝脏变性程度显著降低。综上说明，雪莲培养物对小鼠酒精肝损伤具有一定的保护作用。

表4 雪莲酒对小鼠肝脏中MDA、GSH、TG含量的影响(x±s)

对小鼠进行不同酒剂灌胃，分别给予雪莲酒或基酒半小时后，小鼠相继出现不同程度的醉酒反应，如精神不振和饮水量减少、活动少、走路不稳、反抗力减弱、翻正反射消失、四肢皮温高、心跳加快、易激惹、普遍出现用前爪挠嘴等现象。在醉酒后5～7 h，行为逐渐恢复正常状态，雪莲酒各剂量组的小鼠相对于基酒各剂量组的小鼠，醉酒行为较快恢复到正常状态。实验结果表明，基酒A 组与雪莲酒A 组小鼠血清中乙醇浓度均与灌胃剂量成正比。与基酒A 组小鼠比较，各个时间点相应剂量的雪莲酒A 组小鼠血液中乙醇含量均降低。对小鼠进行雪莲酒和基酒灌胃后，与基酒B 组比较，雪莲酒B 组小鼠醉酒行为较快恢复正常状态。经连续灌胃两个月后，基酒B 组MDA、TG 含量明显升高，基酒和雪莲酒组GSH 含量均降低，基酒B 组的GSH降低程度更加明显。以上结果说明，与基酒比较，雪莲酒一定程度上促进了小鼠血液的酒精代谢速度，同时雪莲酒对肝脏损伤程度较小。

本研究分析结果表明，雪莲培养物对小鼠急性酒精肝损伤具有一定的保护作用，雪莲酒促进了小鼠血液的酒精代谢速度，对肝脏损伤程度较小。研究对进一步酒精性肝损伤保护研究具有重要意义，为雪莲酒的开发利用提供了理论依据。