葡萄田间愈伤组织诱导研究

姜英，姜福莉，赵紫蝶，王娜，秦子禹

（河北科技师范学院园艺科技学院，河北秦皇岛 066004）

果树多倍体通常表现出树壮、抗病、丰产、果大、无籽或少籽等优异性状，多倍体育种己成为果树品种改良的重要途径。相对于苹果、梨、桃等二倍体较大果型水果，多倍体葡萄的大果粒、无籽或少籽的优点显得更为突出，因此葡萄多倍体育种也成为其种质创新的重要途径。多年来杂交育种是葡萄多倍体育种的常规方法[2]，目前育成的多倍体葡萄品种约有68%为杂交方法育成[3]。人工诱变创造多倍体相对于传统杂交育种具有时期短的优点，但传统的田间茎尖多倍体诱变，嵌合现象严重，纯化过程费时费力，组培条件下的多倍体诱变则存在进入田间评价需时较长等问题。因此田间诱导愈伤组织获得纯合多倍体成为一项更为理想的技术方法，不仅可以快速诱导获得纯合多倍体，而且加倍的不定芽当年可发育形成木质化枝条，用于嫁接扩繁，可大大缩短多倍体育种周期，同时还可彻底解决嵌合体纯化难题[4]。

目前，在枣树、榆树、海棠、五角枫、石榴等植物中已成功建立田间愈伤组织途径免嵌合体纯化多倍体诱导[5-7]。在葡萄上，诱导愈伤组织大多是在离体条件下进行，并未进行田间多倍体诱导[8-17]。吴红等[18]用‘维多利亚’葡萄试管苗单芽茎段诱导得到四倍体；集贤等[19]利用‘优无核’葡萄组培苗的不同芽位获得多倍体；王敏琴等[20]报道了离体条件下诱导葡萄花药、花丝产生愈伤组织，并利用秋水仙素溶液处理胚状体及幼苗，获得葡萄多倍体试管苗；杨晓明[21]利用茎段和叶片为外植体产生愈伤组织，并用秋水仙素溶液处理腋芽获得多倍体。但这些报道大都是嵌合体，需进一步纯化才能获得纯合多倍体。

目前，葡萄田间愈伤组织诱导多倍体鲜有报道。因此，本文以葡萄嫩枝为试材，研究了田间条件下包裹方式、激素等因素对葡萄新梢愈伤组织诱导的影响，为下一步从愈伤组织诱导葡萄多倍体或进行遗传转化奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验地点

本试验在河北科技师范学院园艺园林实验站葡萄育种基地和昌黎县施各庄葡萄育种基地进行。

1.2 试验材料

试验共设置7种处理方式，其中包裹方法、噻苯隆（TDZ）、硝酸银（AgNO3）、短截时期、新梢粗度、短截部位的研究均用‘巨峰’葡萄为材料，基因型处理用‘巨峰’‘赤霞珠’‘温克’‘A-09’葡萄为材料。树龄均为7年生，避雨棚篱架栽培，常规管理模式。

1.3 试验设计

于2021年5—8月，将葡萄新梢短截后用脱脂棉覆盖截面，用胶头滴管滴加激素，以浸湿脱脂棉为宜，一般需要滴加2～3 mL，最后进行包裹。

1.3.1 包裹方式对新梢截面愈伤组织的影响

新梢短截后，在截面覆上脱脂棉滴加激素TDZ（8.0 mg·L-1）和硝酸银（2.0 mg·L-1）。新梢截面采用3种方式进行包裹，方式1（黑袋）、方式2（黑袋+湿泥+黑袋）、方式3（湿泥+黑袋）。每个处理短截新梢10个，重复3次，30 d后调查愈伤组织诱导率与愈伤组织等级情况，找出截面最佳包裹方式。在以下处理中均采用最佳包裹方式。

1.3.2 TDZ对新梢截面愈伤组织的影响

在新梢截面形成层滴加不同浓度的TDZ（4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg·L-1）+AgNO32.0 mg·L-1。每个处理短截新梢10个，重复3次，30 d后调查愈伤组织诱导率与愈伤组织等级情况。

1.3.3 AgNO3对新梢截面愈伤组织的影响

新梢短截后在截面形成层滴加AgNO3（2.0、4.0、6.0 mg·L-1）+TDZ 10.0 mg·L-1。每个处理短截新梢10个，重复3次，30 d后调查愈伤组织诱导率与愈伤组织等级情况。

1.3.4 短截时期对新梢截面愈伤组织的影响

分别在5月底、6月底和7月底将新梢短截，截面滴加TDZ 10.0 mg·L-1+ AgNO32.0 mg·L-1后进行包裹。每个处理短截新梢10个，重复3次，30 d后调查愈伤组织诱导率与愈伤组织等级情况。

1.3.5 新梢粗度对截面愈伤组织的影响

分别将直径为0.6、1.0、1.2 cm的新梢进行短截，截面滴加TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后进行包裹。每个处理短截新梢10个，重复3次，30 d后调查愈伤组织诱导率与愈伤组织等级情况。

1.3.6 短截部位对新梢截面愈伤组织的影响

新梢短截部位分别在节间与节部，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后进行包裹。每个处理短截新梢10个，重复3次，30 d后调查愈伤组织诱导率与愈伤组织等级情况。

1.3.7 基因型对新梢截面愈伤组织的影响

以‘巨峰’‘赤霞珠’‘温克’‘A-09’为试材，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1后进行包裹。每个处理短截新梢10个，重复3次，30 d后调查愈伤组织诱导率与愈伤组织等级情况。

1.4 数据处理

新梢截面愈伤组织诱导量的分级标准参照文献[22]并稍做修改，如下：

0：无愈伤组织；+：木质部和韧皮部之间可见愈伤组织；++：愈伤组织超出形成层，愈伤组织环更加明显；+++：愈伤组织环继续加粗，宽度约占截面半径的1/5～1/2；++++：愈伤组织环约达截面半径的1/2；+++++：愈伤组织环超过截面半径的1/2；++++++：愈伤组织呈蘑菇状溢出。

新梢愈伤组织诱导率（%）=截面出愈伤新梢数/短截总新梢数×100

试验数据采用DPS数据处理系统进行统计分析，用Duncan新复极差法进行差异显著性分析，用不同字母表示其差异显著性，大写字母为（P<0.01），小写字母（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 包裹方式对新梢截面愈伤组织的影响

如表1所示，方式1和方式2覆盖后新梢截面愈伤诱导率最高达67%和73%，方式3的愈伤诱导率最低为50%。其中方式1的田间操作不仅包裹省时，还省去了湿泥的繁琐，但是方式2的愈伤在颜色和质地方面好于方式1，且诱导率和愈伤组织等级都高于方式1。

表1 包裹方式对新梢截面愈伤组织的影响Table 1 Effect of wrapping method on callus of new shoot section

2.2 TDZ和AgNO3对新梢截面愈伤组织的影响

由表2可以看出，愈伤组织诱导率随着TDZ浓度的增加而增加，浓度在4.0 mg·L-1和6.0 mg·L-1时诱导率最低，仅为30%；在TDZ 10.0 mg·L-1和12.0 mg·L-1时诱导率最高，达80%。但TDZ 10.0 mg·L-1的愈伤组织等级大于12.0 mg·L-1。所以本研究以TDZ10.0 mg·L-1为最佳截面愈伤组织诱导浓度。

表2 不同浓度的TDZ和AgNO3对新梢截面愈伤组织的影响Table 2 Different concentration of TDZ and AgNO3 on the callus of new shoot section

葡萄新梢短截后，在TDZ 10.0 mg·L-1附加AgNO3各浓度对截面愈伤组织诱导率有显著影响。由表2可以看出，愈伤组织诱导率随着AgNO3浓度的增加而降低，AgNO3浓度为6.0 mg·L-1时愈伤诱导率最低，为47%；在AgNO32.0 mg·L-1时的愈伤诱导率最高，达到80%，且愈伤组织等级和诱导率都显著高于其它两个浓度。所以以TDZ 10.0 mg·L-1+AgNO32.0 mg·L-1为最佳截面愈伤组织诱导浓度。

2.3 短截时期对新梢截面愈伤组织的影响

由表3可以看出，5月下旬的愈伤诱导率最低，达50%；7月下旬的愈伤诱导率最高，达90%。

表3 短截时期对新梢截面愈伤组织的影响Table 3 Effects of short cut period on the callus of new shoot section

2.4 新梢粗度对新梢截面愈伤组织的影响

由表4可知，在新梢粗度1.0～1.2 cm时，新梢截面的愈伤组织诱导率达87%；新梢粗度1.0 cm以上时，新梢截面愈伤组织诱导率效果好；新梢粗度0.6 cm以下时，新梢截面愈伤组织诱导率最低，仅为33%。这是由于新梢粗度不同，木质化程度不同，新梢越粗，形成层越宽，可形成的愈伤组织环就越宽，更利于愈伤组织的形成。

表4 新梢粗度对新梢截面愈伤组织的影响Table 4 Effect of shoot thickness on callus of shoot section

2.5 短截部位对新梢截面愈伤组织的影响

由表5可知，节间和节部愈伤组织诱导率接近，为90%左右。在新梢节部营养丰富，易于愈伤组织形成，但是节部芽点较多，诱导后易于形成嵌合体，所以节间为最佳部位。

表5 短截部位对新梢截面愈伤组织的影响Table 5 Effect of short section on callus of new shoot section

2.6 基因型对新梢截面愈伤组织的影响

利用前面筛选的最佳包裹方式、激素组合、新梢粗度等处理，对4个葡萄基因型新梢进行截面诱导，所有基因型均成功诱导出愈伤组织。如表6所示，‘巨峰’和‘赤霞珠’的愈伤组织诱导率和等级都显著高于其它两个基因型，愈伤组织等级达到6级，其它两个基因型愈伤组织等级为4级。‘巨峰’和‘赤霞珠’诱导率最高，达87%。‘温克’的诱导率最低，为60%。

表6 基因型对新梢截面愈伤组织的影响Table 6 Induction of callus from new shoot sections of different grape varieties

3 讨论

以往研究中，枣树、榆树、海棠、五角枫、石榴等植物中已成功建立田间愈伤组织途径，这些植物一般选择在多年生枝干截枝诱导愈伤组织。本科研团队多年来在葡萄多年生枝蔓进行了截枝预试验，结果树会发生严重的整株死亡现象，这些都使葡萄田间诱导愈伤组织的难度加大。因此选择对葡萄新梢进行截枝，很大程度减少了对树体的伤害，同时利用不同包裹方式和激素组合成功诱导出了愈伤组织。

从愈伤组织存在部位和形态来看，其主要源于木质部和韧皮部之间的形成层。新梢被短截后裸露的截面极易风干，愈伤组织难以形成。因此，为得到新梢截面愈伤组织，采取覆盖措施保护截面并搭配适宜的激素组合就显得非常重要。本试验设计的3种覆盖方式中，由于葡萄新梢田间条件下愈伤组织诱导时间较长，最短也要15 d以上，所以包裹材料选用黑塑料袋和湿泥，以遮阴保湿为主要目的。就目前田间试验情况来看，湿泥直接覆盖截面，可以降低温度，减少酚类化合物的合成，减少褐化，但因湿泥中混有杂菌，形成层直接接触后极易霉变。所以本试验对新梢截面采用了（黑塑料袋+湿泥+黑塑料袋）的三重长效保湿方式，第一层的黑袋起到了隔离截面杂菌的作用，第二层湿泥和第三层黑袋起到长久保湿的作用，利用该方法在葡萄新梢获得了最佳愈伤组织诱导率。

另外，愈伤组织的获得一般是将成熟的体细胞“逆转”到分化程度较低的状态并恢复其增殖能力，其中正常细胞的多少直接影响其分化与再生能力，获得的愈伤组织遗传性状比较稳定[23-25]。激素浓度、新梢粗度、短截部位等均对愈伤组织诱导有显著影响，本试验采用TDZ复合AgNO3处理诱导愈伤效果显著，最适宜的TDZ浓度为10.0 mg·L-1。AgNO3浓度的升高反而对愈伤诱导存在抑制作用，适宜的AgNO3浓度为2.0 mg·L-1，这与前人枣树研究结果一致[26]。6—7月愈伤组织诱导率显著大于5月，可能与温度有关，昌黎地区5月底平均气温为20 ℃，低于7月底均温27 ℃。彭向永等[27]研究表明，适宜愈伤组织产生的温度范围为25～28 ℃，低于或高于此温度范围时愈伤组织发生率均降低，这与本研究的结果一致。葡萄新梢比较细嫩，新梢越粗，愈伤诱导效果越好，但是过粗的新梢意味着更大的髓部，不利于愈伤组织的诱导，因此适宜的新梢粗度为1.0～1.2 cm。节间和节部的愈伤诱导率差异不显著，愈伤组织等级有明显差异，但是葡萄节部营养丰富，在后期芽的再生中易出现嵌合体，不能达到理想效果，所以节间为最佳部位。

芽的再生体系可通过田间和离体的方式获得。到目前为止，葡萄芽再生研究基本都是在离体条件下进行[28-29]。但离体培养需无菌条件、人为补充光照，并且操作繁琐、技术要求高、成本高、耗时长，获得的组培苗生长缓慢，进入开花结果耗时较长[30]。而田间条件下树体再生系数高，生长较快，再生芽当年可发育为木质化枝条，并能开花结果，诱变后易获得纯合体[31]。本试验探究出了适于葡萄田间条件下直接诱导愈伤组织的最佳包裹方式和激素组合，且诱导的愈伤组织等级达到六级，为下一步从愈伤组织诱导出芽进而诱导同源多倍体奠定基础，对于多倍体葡萄育种具有重要意义。

4 结论

本研究对葡萄进行了田间条件下直接诱导愈伤组织，7月底对直径1 cm以上的葡萄新梢在节间进行短截，截面滴加激素TDZ 10.0 mg·L-1+ AgNO32.0 mg·L-1后，采用黑袋+湿泥+黑袋的三重长效保湿方式进行覆盖包裹，葡萄新梢愈伤组织诱导率可达90%。4个基因型中以‘巨峰’‘赤霞珠’诱导率较高，达87%。