复合液体肥对‘夏黑’葡萄园土壤微生物多样性的影响

郑秋玲，刘军鹏，郑媛媛，王建萍，卢建声，肖慧琳，刘万好，唐美玲，陈景辉，徐维华，孙行杰

（1. 山东省烟台市农业科学研究院，山东烟台 265500；2. 烟台水禾土生物科技有限公司，山东烟台 264003；3. 龙口市农业技术推广中心，山东龙口 265701；4. 山东省酿酒葡萄与葡萄酒技术创新中心，山东烟台 264000）

葡萄具有见效快、收益高等特点，种植面积呈增长态势，已经成为很多地方农业生产的支柱产业，在乡村振兴和精准扶贫中发挥着重要作用[1-3]。葡萄为喜肥果树，且在不同生育期对氮、磷、钾、钙、镁等矿质元素的需求规律不同[4-5]，传统的重施氮磷钾肥而忽视钙镁肥的方式不仅导致树体生长失衡、果实品质下降，也会造成肥料利用率下降和生产成本增加[6]。液体肥通过水肥一体化技术施用具有肥效高、容易吸收、养分均匀、配方可调、施用方便等优点，可以实现精确供给[7-8]。目前，关于液体肥在葡萄上的应用效果主要集中在提高产量、改善品质方面。于会丽等[9]试验证明海藻水溶肥配施可提高葡萄产量、增加果实香气；王振龙[10]认为，适当补充腐殖酸、氨基酸以及有益功能菌可以提高葡萄的花色苷及多酚含量；吕中伟等[11]证实不同类型液体肥可增加‘阳光玫瑰’葡萄可溶性固形物及Vc含量，同时可提高‘红地球’葡萄产量，改善果实品质[12]，而针对液体肥影响葡萄土壤根际微生物的研究较少。

土壤根际微生物在植物生长发育过程中发挥了重要作用，其种类受土壤类型、植物种类、种植模式等因素影响[13-14]。目前葡萄园土壤微生物的研究多集中在水分管理[15-17]、产区[18-19]及土壤管理方式[20-21]等农艺措施对微生物多样性的影响。本研究以‘夏黑’葡萄为试材，采用Illumina PE250平台对其进行16S细菌rRNA和ITS真菌高通量测序分析，探讨施用液体肥后葡萄根际土壤微生物多样性和群落结构变化情况，阐明不同液体肥对葡萄根际土壤微生物群落结构间的影响，为液体肥的推广和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在山东省农业科学研究院蓬莱试验基地进行。园区土壤pH值6.51，有机质含量1.45%，碱解氮（AN）41.2 mg·kg-1，速效磷（AP）34.5 mg·kg-1，速效钾（AK）132.5 mg·kg-1。试材为5年生‘夏黑’葡萄，株行距为3 m×4 m，龙干棚架，水平叶幕。花果管理：花前一周保留穗尖5～7 cm，盛花期采用25 mg·L-1GA3＋2 mg·L-1CPPU喷果穗，花后2周采用25 mg·L-1GA3进行膨大处理。

1.2 试验设计和取样方法

液体肥来自烟台水禾土科技有限公司，主要成分为：枯草芽孢杆菌（有效活菌数≥5亿 cfu·mL-1）、壳寡糖（氨基酸≥100 g·L-1，Zn＋B≥20 g·L-1，壳寡糖5%）、鱼蛋白（氨基酸≥100 g·L-1，N＋P2O5＋K2O≥150 g·L-1，有机质≥300 g·L-1）、植物免疫蛋白（0.1%超敏蛋白，氨基酸≥100 g·L-1，Zn＋B≥20 g·L-1）、海藻寡糖（腐殖酸≥6%，N＋P2O5＋K2O≥26%，有机钾≥18%，海藻寡糖≥5%）。

试验处理：液体肥复合处理（T）采用烟台水禾土科技有限公司的系列产品，对照（CK）为常规土壤施肥，处理方案见表1。每个处理3个小区，每小区10株，共计30株，小区随机分布。施肥方式为：常规施肥采用沟施，距树干30 cm处开沟（深、宽均为20 cm沟），固体肥料撒施入沟内，覆土后浇透水；液体肥采用沟施与叶面喷施相结合的方式进行，液体肥料稀释100倍后浇入沟内，覆土后浇水。

表1 不同处理施肥时期、方法及用量Table 1 Fertilization period, method and amount of different treatments

取样方法：葡萄采收期用不锈钢取土器配合橡胶锤采集树干与施肥沟间的土壤，采集深度为0～30 cm，每个处理采集3个混合土样，每个样本由15个采样点的土壤混合而成，1个混合土样1000 g，混合均匀后土壤样品分为两组，一组液氮速冻，置于﹣80 ℃冰箱保存，送样进行土壤微生物测定；另一组自然风干过筛后测定相关理化指标。

1.3 测定方法

1.3.1 土壤理化指标

土壤有机质采用重铬酸钾容量法-稀释热法测定；pH用1∶1水土比，pH计测定；碱解氮采用碱解扩散法；有效磷采用NaHCO3浸提，硫酸钼锑抗比色法；土壤速效钾：醋酸铵浸提，火焰光度法测定；交换性钙镁采用1 mol·L-1NH4OAc溶液浸提，原子吸收分光光度计测定。

1.3.2 微生物群落分析

用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross，GA，US）试剂盒提取土壤总DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。土壤细菌扩增引物为341F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'），土壤真菌扩增引物为ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25个循环，最后于72 ℃延伸5 min。扩增产物经电泳检测，用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收，回收的产物由上海凌恩生物科技有限公司基于Illumina PE250平台高通量测序。测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，用Usearch软件和gold数据库，采用denovo和reference结合的方式去除嵌合体，区分样本后进行分类单元（Operational Taxonomic Units，OTU）聚类分析和物种分类学分析，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析（置信度阈值为0.7），比对数据库为Silva（细菌）和Unite（真菌），统计各样本的群落组成。

不同指数的计算方法如下：

Chao：是用chao1算法估计样本中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，由Chao（1984）最早提出。本次分析使用计算公式如下：

其中，Schao1为估计的OTU数；Sobs为实际观测到的OTU数；n1为只含一条序列的OTU数目；n2为只含两条序列的OTU数目。

Simpson：用来估算样本中微生物多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson (1949) 提出，在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性。Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。

其中，Sobs为实际观测到的OTU数；ni为第i个OTU所含的序列数；N为所有的序列数。

Shannon：用来估算样本中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数常用于反映α多样性指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。

其中，Sobs为实际观测到的OTU数；ni为第i个OTU所含的序列数；N为所有的序列数。

Coverage：是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。

其中，ni为第i个OTU所含的序列数；N为所有的序列数。

1.4 数据分析

数据统计用Excel 2010，显著性分析用SPSS 19.0。

2 结果与分析

2.1 液体肥处理对土壤理化性状的影响

由表2可知，与对照相比，液体肥处理显著提高了土壤有机质、碱解氮、有效磷、速效钾及交换性钙含量，分别增加了19.62%、39.64%、12.10%、19.49%、33.97%；pH值、交换性镁与对照相比没有显著性差异。

表2 施肥处理对土壤理化指标的影响Table 2 Effect of the fertilization treatment to physical and chemical properties of tested soil samples

2.2 液体肥处理对根际土壤细菌群落结构的影响

2.2.1 施肥处理对根际土壤细菌多样性的影响

由表3可知，液体肥处理与常规施肥葡萄植株根际土壤细菌的Coverage指数均在98%以上，表明测序结果可代表样本中细菌的真实状况。液体肥处理的葡萄根际土壤的OTU数、Chao指数、Simpson指数显著高于对照，Shannon指数无显著性差异。

表3 不同处理土壤中细菌α多样性指数统计Table 3 Alpha diversity index statistics of bacteria in the rhizosphere soil of different treatments

2.2.2 施肥对根际土壤细菌门分类水平的影响

本研究中检测到的根际土壤细菌OTU归类到36门97纲230目359科700属，表4为不同处理‘夏黑’根际土壤中细菌在门分类学水平上的主要物种分布种类及丰度。施用液体肥与常规肥的葡萄根际土壤中，占比大于1%的优势菌门分别为10个和11个。共有的超过10%的优势菌门有4个：变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）；低于介于1%～10%的优势菌门为：拟杆菌门（Bacteroidota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、粘球菌门（Myxococcota）、Atescibacteria、硝化螺旋菌门（Nitrospirota）。

表4 根际土壤细菌门分类水平组成与丰度Table 4 Relative abundance of bacteria phylum in rhizosphere soil%

与常规施肥相比较，液体肥处理的变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、Atescibacteria丰度增加9.53、0.87、0.12、1.99、0.61、1.12个百分点；酸杆菌门、疣微菌门、粘球菌门、硝化螺旋菌门、Methylomirabilota丰度降低10.90、0.83、0.68、0.11、1.26个百分点。

2.2.3 根际土壤细菌属分类水平

本研究测定的葡萄根际土壤微生物中，相对丰度大于1%的优势细菌属共有15个，其中液体肥处理的1%优势细菌属有14个，常规施肥处理的有13个（表5），液体肥处理的葡萄根际土壤中富集罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）、链霉菌属（Streptomyces）优势细菌属，常规施肥处理富集了酸性细菌属（Acidobacteriales）特有优势细菌属。

表5 根际土壤细菌属分类水平组成与丰度Table 5 Relative abundance of bacteria genus in rhizosphere soil %

液体肥复合处理相对丰度前4位的分别为RB41、芽单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、Gaiellales；常规对照的相对丰度前4位的属为：酸杆菌属、RB41、Gaiellales、芽单胞菌属。

与常规施肥相比，液体肥复合处理的葡萄根际土壤中鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、RB41、Candidatus Udaeobacter、黄色杆菌科及两个优势菌属相对丰度分别增加了2.28、0.22、0.46、0.21、0.51、0.11、0.10个百分点；酸杆菌属、Gaiellales、Roseiflexaceae_uncultured、Vicinamibacteraceae_norank、慢生根瘤菌属优势菌属相对丰度分别下降了2.36、1.27、0.12、2.05、0.21个百分点。

2.3 液体肥对葡萄根际土壤真菌群落结构的影响

2.3.1 根际土壤真菌多样性

由表6看出，不同处理的葡萄根际土壤的Coverage指数均在99%以上，说明测试结果代表样本中真菌的真实情况。施肥处理的OTU数、Chao指数、Simpson指 数显著高于对照；Shannon指数显著低于对照。

表6 不同处理中土壤中真菌α多样性指数统计Table 6 Index statistics for alpha diversity of fungi in the rhizosphere soil of different treatments

2.3.2 根际土壤真菌菌门分类水平

不同处理‘夏黑’根际土壤真菌OTU归类到7门25纲145目145科277属，液体肥复合处理和常规施肥的葡萄根际土壤中，相对丰度大于1%的优势真菌门有3个（表7），分别为：子囊菌门（Ascomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）、担子菌门（Asidiomycota）；其中液体肥复合处理根际土壤中三者的相对丰度分别为78.70%、11.37%和4.21%，常规施肥处理葡萄植株根际土壤中三者的相对丰度分别为62.04%、14.66%、16.68%。可以看出，采用液体肥料复合施用使葡萄根际土壤真菌优势菌门占比发生变化，子囊菌门占比增加，毛霉菌门和担子菌门占比减少。

表7 根际土壤真菌门分类水平组成与丰度Table 7 Relative abundance of fungi phylum in rhizosphere soil%

2.3.3 根际土壤真菌属分类水平

液体肥复合处理和常规施肥的葡萄根际土壤中，相对丰度大于1%的优势真菌属分别为15个和13个（表8），不同处理富集的优势菌属不同，液体肥处理的葡萄根际土壤富集了头束霉属、Fusicolla、枝孢属、瓶毛壳属、Podospora、Dendrostilbella特有的优势真菌属；常规施肥处理根际土壤富集了毛霉菌属、Phoma、小不整球壳属、柄孢壳属特有优势菌属。

表8 根际土壤真菌属分类水平组成与丰度Table 8 Relative abundance of fungi genus in rhizosphere soil%

两处理共有的优势菌属有9个，分别为毛葡孢属（Botryotrichum）、镰刀菌属（Fusarium）、被孢霉属（Mortierella）、腐质霉属（Humicola）、短柄菌属（Solicoccozyma）、Gibellulopsis、毛壳菌属（Chaetomium）、盘菌属（Tricharina）、Tausonia。与常规施肥相比，水溶肥复合处理的葡萄根际土壤中毛葡孢属、镰刀菌属、短柄菌属、Gibellulopsis、盘菌属的相对丰度分别增加9.08、2.70、1.49、1.24、0.61个百分点，被孢霉属、腐质霉属、毛壳菌属、Tausonia的相对丰度分别降低3.29、8.05、0.38、3.21个百分点。

2.4 土壤微生物与矿质元素的冗余分析

通过对液体肥处理和常规施肥处理的葡萄根际土壤样品细菌和真菌群落结构与土壤理化性质的RDA冗余分析，可直观看出土壤有机质、pH、速效磷、速效钾及交换性钙镁等指标对土壤微生物细菌（图1左）和真菌（图1右）影响作用一致，细菌中变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门与有机质、pH、速效磷、速效钾及交换性钙镁等指标正相关；真菌门水平的子囊菌门与有机质、pH值、速效磷、速效钾及交换性钙镁等指标正相关。

图1 细菌（左）和真菌（右）门水平群落结构与土壤理化性质间的冗余分析Figure 1 Redundancy analysis of bacterial (Left) and fungal (Right) community structure and soil

3 讨论

土壤中的微生物是提高土壤生态功能的重要群体，在有机质周转、物质循环等活动中起着举足轻重的作用[23]。前人研究表明，不同施肥处理对土壤细菌和真菌的群落结构和生物多样性产生一定影响。本研究中发现施用液体肥可显著提高土壤部分矿质元素及有机质含量，这是因为液体肥中含有的氨基酸态氮、腐殖酸和有机酸等成分，通过螯合作用和酸溶解作用促使土壤中固化的氮素、磷素和钾素转化为更易吸收的矿化态[22-24]，因此提高了土壤中氮、磷、钾的有效性。施用液体肥处理的葡萄根际土壤的细菌和真菌的OTU数、Chao指数、Simpson指数、Shannon指数高于常规施肥处理，这可能是由于施入液体肥，为微生物提供了可直接利用的营养物质，增加了微生物的数量及多样性[25]，这与桑文等[26]在番茄中的研究结果一致。

本研究表明，施用液体肥对土壤微生物结构及活性影响较大，尤其是对细菌影响较大。施用液体肥处理的变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门的丰度高于常规施肥处理，这些菌门有助于根系吸收更多的钾、磷和其他微量营养元素[27]。本研究中通过门水平群落结构与土壤理化指标间的冗余分析也得出变形菌门、放线菌门、拟杆菌门与土壤矿质元素指标之间存在正相关，说明两者之间可能存在互相促进的关系。施用液体肥处理提高了根际土壤中子囊菌门的丰度，降低了毛霉菌门和担子菌门丰度。研究表明，子囊菌门是土壤有机质和纤维素的主要分解者[28]，施入液体有机肥后，刺激了子囊菌门的生长，更有利于葡萄吸收土壤营养。Lauber等[29]研究发现，担子菌门的相对丰度与土壤中C/N和有效磷含量成反比，本研究中施用液体肥提高了土壤有机质、有效磷等矿质元素含量，冗余分析表明毛霉菌门和担子菌门丰度与土壤理化指标呈负相关，可能是土壤中担子菌门丰度降低的原因。

4 结论

与常规肥相比，液体肥处理显著提高了细菌和真菌的多样性和丰度；细菌门水平上变形菌门、放线菌门、绿弯菌门等相对丰度增加，属水平上鞘氨醇单胞菌属、芽单胞菌属、RB41等优势菌属相对丰度增加；真菌门水平上葡萄根际土壤中优势菌群子囊菌门丰度增加，毛霉菌门、担子菌门丰度有所下降，属水平上毛葡孢属、镰刀菌属、短柄菌属等的相对丰度增加。土壤有机质、pH、速效磷、速效钾及交换性钙镁等指标与微生物群落结构存在相关性。