‘赤霞珠’种子成熟过程中缩合单宁的变化及其与颜色参数的相关性

刘敖一，夏弄玉，王京京，孙琪，潘秋红

（中国农业大学食品科学与营养工程学院/农业农村部葡萄酒加工重点实验室，北京 100083）

葡萄果实中重要的酚类物质有酚酸、黄酮醇、黄烷醇、花色苷和单宁，它们可以在葡萄酒酿造过程中浸出、转化和衍生，从而决定了葡萄酒的颜色、口感、收敛性和陈酿潜力[1]。葡萄酒中酚类物质的种类和含量主要取决于果实，且与果实成熟度密切相关[2]，基于此，越来越多的葡萄酒生产者对葡萄果实成熟采收时期的判断，除了考虑糖、酸含量之外，还特别关注酚类物质。

单宁是葡萄酒中一类非常重要的酚类物质，根据其结构和水解性质，可分为水解单宁（Hydrolyzed tannins）和缩合单宁（Condensed tannins）。水解单宁是由棓酸或棓酸衍生的酚羧酸与多元醇所组成的酯在酸、碱和酶的作用下产生的多元醇和酚羧酸，主要来源于橡木桶陈酿和外源性酚类，少量来源于葡萄的果皮和种子，对酸和热的稳定性不及缩合单宁；缩合单宁又称原花色素（Proanthocyanidins, PA），是由黄烷-3-醇单体聚合而成，葡萄酒中的PA主要来源于果皮和种子，葡萄种子的PA含量高于果皮，聚合度略低于果皮[3]。相对而言，葡萄果皮的PA容易浸出，在酒精发酵初期可大量浸提出来，而种子的PA浸出量较低，但在发酵后期或后浸渍阶段，种子PA浸出速度加快，使得其在红葡萄酒最终产品中的含量占比高于果皮PA[4]。葡萄果实不同来源的PA对葡萄酒滋味和口感有不同的影响，种子PA具有中等聚合度，总体上其涩感强度弱于果皮PA，优质葡萄酒的特点是种子单宁与果皮单宁的平衡[5]。在一些炎热葡萄酒产区，由于果实成熟和种子成熟不同步，导致酿酒葡萄采收时种子未达到成熟状态，从而对葡萄酒品质有较大影响[6]。因此，探究酿酒葡萄种子PA在果实发育过程的变化，找到快速判断种子PA成熟的方法对葡萄酒酿造具有重要的意义。但是由于种子PA提取难度和分析方法的复杂性，目前关于它的研究相对较少。

PA可以与口腔中的蛋白质结合，从而在口腔中引起涩感。许多研究表明，涩感强弱与PA浓度和平均聚合度（mean degree of polymerization, mDP）呈现正相关[7-10]。PA的溶解度随聚合度的增加而降低，利用其在丙酮水溶液中的溶解性，可分为可溶性PA和非可溶性PA[11]。通常认为，可溶性PA能够在发酵过程中进入酒体，从而对葡萄酒口感产生影响，而较高聚合度的非可溶性PA在葡萄果实中与细胞壁成分结合，不容易浸到酒体中，即使浸至酒体也可能因分子太大而重新形成沉淀，对最终葡萄酒产品涩感的影响是有限的。以往对于PA聚合度，主要关注其mDP值，测定方法是采用强酸处理使PA水解为单体， PA中的延伸单元可以与亲核试剂——间苯三酚结合，而末端单元不能与间苯三酚结合，从而实现对延伸单元和末端单元的分别计数，并计算mDP值[12]。从其测定原理可以看出，mDP值可以在一定程度上反映PA的聚合度大小，但不能反映PA的溶解性。因此，了解种子成熟过程中可溶性PA和非可溶性PA含量的变化，有助于预测其对葡萄酒感官质量的潜在影响，能够为优质葡萄酒原料采收时期的确定提供参考。

葡萄种子中的单宁主要分布在表皮。已有研究表明，葡萄种皮颜色的变化与葡萄浆果花色苷和果皮总酚含量均显著相关，这也说明种子的外观和颜色可作为浆果整体成熟度的额外指标[13]。在葡萄种子发育过程中，种子表皮颜色由绿色到褐色的变化与种子中总PA含量下降时段一致，其中部分原因可能是由于单宁的氧化而导致种子颜色的加深[11]。通过探究种子表皮颜色的变化规律，建立表面颜色和种子PA含量之间的相关性，以期为实际生产中种子PA成熟度的快速判别提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本研究所用的酿酒葡萄品种为‘赤霞珠’（Vitis viniferaL. cv. Cabernet Sauvignon），以可溶性固形物为标准，2019年在物候期E-L33、E-L35、E-L35.5、E-L36、E-L37、E-L38六个点采样，对应具体时间分别为转色前15 d，转色后0、6、15、46、67 d。采样时设置3个生物学小区，每个小区15株，每次每个小区随机选择30穗果，兼顾阴阳面果穗，共采样300粒，除了50粒用于测定糖、酸含量之外，其余的立即液氮速冻，低温速运至实验室，贮藏于﹣80℃超低温冰箱中备用。果实破碎后取种子，测定表面颜色，之后种子磨粉，用于测定PA及其组成单元的含量。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄果实可溶性固形物和可滴定酸含量测定

取50粒果实，去除种子，将果实破碎、离心（4054 r·min-1，常温）、取汁，采用数显手持糖量计（PAL-1，Atago，Japan）测定葡萄汁的可溶性固形物含量，用百分数表示。参照GBT 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，测定可滴定酸含量，用酒石酸（g·L-1）表示。

1.2.2 种子可溶性和非可溶性PA的提取与测定

参照Yu等[14]进行，稍作修改。可溶性PA的提取与测定：取100 mg种子样品粉末于2 mL离心管中，向样品中加入1 mL单宁提取缓冲液（70%丙酮，0.1%乙酸，Vol），在冰水中超声30 min，4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，取上清，沉淀按照上述步骤再提取两次，合并3次得到的上清液，即为可溶性PA的粗提液。沉淀用于非可溶性PA的测定。

将上清液与等体积氯仿混合充分，4 ℃下以4054 r·min-1离心5 min，弃下层有机相，重复3次；在上层溶液中加入等体积正己烷，涡旋混合，4 ℃下以9730 r·min-1离心5 min，保留下层溶液，重复3次。对所得下层溶液氮吹，直至液面基本不变，液氮速冻，放于﹣20 ℃下冷冻干燥后，用600 μL 50%（Vol）色谱级甲醇/水溶液复溶，即得到可溶性PA提取液。每个样品提取3份，分别用于以下测定。

取2 μL各样品可溶性PA提取液以及各2 μL的0、0.75、1、1.5、3 mg·mL-1(-)-表儿茶素标准溶液于96板各孔中，随后向各孔中加入100 μL 4-二甲基氨基肉桂醛（4-dimethyl-amino-cinnamaldehyde, DMACA）反应液（0.2% DMACA, w/v）溶于1∶1甲醇/3 N盐酸。将96孔板放入Spectramax190酶标仪（美国Molecular Devices）中，室温下轻轻震荡5 min后，在640 nm下测量各孔的吸光值。种子可溶性PA的含量用(-)-表儿茶素浓度对吸光值制作的标准曲线进行定量，单位为mg·g-1。

非可溶性PA的提取与测定：将上述提取可溶性PA时得到的沉淀冻干，向干燥粉末中加入500 μL丁醇/浓盐酸（95%丁醇，5%浓盐酸，Vol）溶液，涡旋震荡使沉淀重悬，置于冰水混合物超声处理30 min，4 ℃下以12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，即得到非可溶性PA提取液。

将非可溶性PA提取液以及终浓度分别为0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4 mg·mL-1PB1标准品的丁醇盐酸溶液，分别加入到离心管中，共同在95 ℃下保温1 h，冷却到室温后，用丁醇浓盐酸将样品稀释5倍，取各样品100 μL依次加入到96孔板中，测量各样品550 nm的吸光值，各样品中非可溶性PA的含量用PB1浓度对相应吸光值绘制的标准曲线进行定量，单位为mg·g-1。

1.2.3 葡萄种子PA结构单元含量测定及平均聚合度计算

（1）种子可溶性PA和非可溶性PA中黄烷-3-醇的提取。为测定可溶性PA提取液中的游离态黄烷-3-醇，将上述的可溶性PA提取液，经过0.22 μm滤膜过滤后，在﹣20 ℃下冷冻干燥，冻干的粉末用0.1 mL 50%（Vol）色谱级甲醇/水溶液复溶，可用于可溶性PA中游离黄烷-3-醇含量的测定。

为测定可溶性PA中聚合体的黄烷-3-醇单元含量，将上述可溶性PA提取液，经过0.22 μm滤膜过滤后，在﹣20 ℃下冷冻干成粉末，用0.2 mL间苯三酚裂解液（含0.5 g·mL-1抗坏血酸，0.3 mol·L-1盐酸和50 g·L-1间苯三酚甲醇溶液）复溶；为测定非可溶性PA聚合体的黄烷-3-醇单元含量，则将上述提取得到的非可溶性PA粉末，直接用0.5 mL间苯三酚裂解液复溶。这些复溶液均在避光条件下，在50 ℃金属浴中静置20 min，这时非可溶性PA裂解为不带间苯三酚基团的末端单元和带间苯三酚基团的延伸单元。氮吹至干后，加入100 μL 50%（Vol）色谱级甲醇复溶，溶液用于非可溶性PA聚合体中各种黄烷-3-醇单元含量的测定。

（2）黄烷-3-醇的测定。利用实验室建立的高效液相色谱与质谱联用（HPLC-MS）分析方法[15]。仪器为 Agilent 1290 Infinity II UPLC与6460 triple quadrupole 质谱联用仪，配备 XTerra C18色谱柱。HPLC 洗脱条件如下：A相（含0.1%甲酸的超纯水溶液），B相（含0.1%甲酸的甲醇），流速 0.4 mL·min-1。洗脱程序：0～1 min，5%B；1～2 min，5%～10%B；2～17 min，10%～31%B；17～19 min，31%～95%B；19～20 min，95%～5%B；20～23 min，5%B。采用FIA（Flow Injection Analysis，每次进样量为2 μL）方法配合MassOptimizer软件（Agilent）对质谱检测条件进行优化。质谱检测器参数为：鞘气流速12 L·min-1，温度350 ℃；干燥气流速5 L·min-1，温度300 ℃；雾化气压30 psig；喷嘴电压500 V；毛细管电压2.5 kV；负离子扫描模式；碎裂电压94 V；碰撞能量13 eV。

可检测到的单体为儿茶素（(+)-Catechin，C），表儿茶素（(-)-Epicatechin，EC），表儿茶素没食子酸酯（(-)-Epicatechin gallate，ECG）。其中游离单体从裂解前可溶性PA分离测出；延伸单元通过裂解后可溶与非可溶性PA的延伸单元单体与亲核试剂加成，单独测出计量；末端单元通过测定裂解后可溶性与非可溶性PA未与亲核试剂加成的单体测出（可溶性PA中的末端单元还需减去游离单元含量）。根据保留时间和质谱信息（表1）进行定性，儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯的标准曲线进行定量，用mg·kg-1表示。

表1 各种黄烷-3-醇物质的保留时间和质谱信息Table1 Retention time and mass spectrum information of various flavan-3-ol compounds

（3）平均聚合度计算。平均聚合度（mDP）＝(水解后的延伸单元摩尔数＋水解后的游离单体摩尔数－水解前的游离单体摩尔数)/(水解后的游离单体摩尔数－水解前的游离单体摩尔数)[15]。

1.2.4 酿酒葡萄种子表面颜色测定

利用CM-3700A分光测色计（日本柯尼卡美能达公司）测得种子表面的明度L*值、色相a*值、色相b*值。通过下列公式计算得出色彩属性指标饱和度C、色泽比H、色角度h以及色光值s，以量化种皮的颜色属性，计算公式如下[16]：

其中，色泽比H为正数时代表红色，为负数时代表绿色，数值越大颜色越深；色光值s综合了色彩和明度；色角度h表示色彩的色相，色相环中0°代表紫红色，90°代表黄色，180°代表绿色，当h＞100°时，随h值增加绿色变深，h＜50°时，随h值的增大红色变浅；饱和度C代表色彩的鲜艳程度，也称色彩纯度，即样品除去L*后的单纯色相属性，数值代表与L*垂直的距离，色彩纯度随距离增加而增大，也可以反映出不同颜色色彩的鲜艳程度。

1.3 数据统计分析

数据分析主要采用Eecel、SPSS 20软件分析，黄烷-3-醇的定性定量分析主要采用Qualitative Analysis 10.0和QqQ定量分析软件（Quant-My-Way），绘图软件为Origin 2018，色卡查询及制作软件为Adobe Photoshop 2019。

2 结果与分析

2.1 果实可溶性固形物和可滴定酸含量变化

由图1可知，随着果实成熟，可溶性固形物含量持续升高，而可滴定酸含量相应下降。在转色后46 d，可溶性固形物达到了22.7%，可滴定酸含量为7.59 g·L-1，这时果实已经达到了采收标准。在转色后67 d时，可溶性固形物增至25.25%，可滴定酸含量为6.54 g·L-1，这时的果实被认为处于过熟状态。

图1 ‘赤霞珠’果实可溶性固形物（A）和可滴定酸含量（B）变化Figure1 Variation of soluble solid content (A) and titratable acid content (B) in 'Cabernet Sauvignon'

2.2 种子可溶性PA和非可溶性PA含量的变化

从图2可见，在葡萄果实发育过程中，可溶性PA含量呈现先上升后下降的趋势，峰值出现在转色启动后6 d，含量达到66.35 mg·g-1；相反，非可溶性PA含量持续上升，在本研究最后一个采样点（转色后67 d）达到最大，为6.92 mg·g-1。非可溶性PA含量远低于可溶性PA，但从其占总PA的比例看，随着种子发育，非可溶性PA占比开始变化平稳，随后逐渐增加。在转色期（0 d）占比最低，这说明种子中非可溶性PA占比可随转色后果实成熟进程而增加。

图2 果实发育过程中种子可溶性PA（A）、非可溶性PA（B）含量及非可溶性PA占比（C）的变化Figure 2 Variation patterns of soluble PA (A)，insoluble PA (B) content and the proportion of insoluble PA (C) in seeds

2.3 果实种子PA结构单元的变化

无论是游离的黄烷-3-醇还是种子PA的结构单元，葡萄种子中可检测到的黄烷-3-醇主要有3种，分别是儿茶素（C）、表儿茶素（EC）和表儿茶素没食子酸酯（ECG），在种子成熟过程中，它们的含量变化呈现不同的趋势。

由图3可知，发育早期的种子中，游离单体中含量最高的是ECG；随着种子发育，游离的C、EC和ECG单体含量变化均为先增加后减小，暗示着随种子成熟，越来越多的游离态黄烷-3-醇参与到PA的形成中。

图3 葡萄种子发育过程中游离黄烷-3-醇单体的变化Figure 3 Variation of free-form flavan-3-ols during grape seed development

由表2可知，ECG是可溶性PA的主要末端单元，其在种子发育过程中含量变化不显著，而末端单元C和EC的含量随种子发育先增加后减小之后略微升高；EC是主要的延伸单元，但其含量在发育过程中变化也不显著，C和EC的延伸单元则呈现先减少后期略有增加的趋势。

表2 葡萄种子发育各个时期可溶性PA的末端单元和延伸单元的含量Table 2 Contents of terminal and extension unit of soluble PA in grape seed developmentmg·g-1

由表3可知，葡萄种子中非可溶性PA末端单元以ECG为主，而延伸单元以EC为主，并且EC在非可溶性PA结构单元组成中有非常高的占比。随着种子的发育，末端单元的单体变化趋势相似，总体都是先增加后减少，在转色后15 d或46 d达到最大值；EC和ECG延伸单元都是先减少后增加，之后变化不显著，而C总体呈现增加趋势，这与非可溶性PA含量的增加是相符的。

表3 葡萄种子发育各个时期非可溶性PA的末端单元和延伸单元的含量Table 3 Contents of terminal and extension unit of insoluble PA in grape seed development mg·g-1

2.4 果实成熟过程中种子PA的mDP值变化

图4 种子发育过程中可溶性及非可溶性PA的 mDP值变化Figure 4 Variation of mDP in soluble PA and insoluble PA during grape seed development

在种子发育过程中，可溶性PA的mDP值先呈下降趋势，在转色启动开始达到最小为6.50，之后略有上升，变化不显著；而非可溶性PA的mDP值变化趋势与可溶性PA相似，但是达到最低的日期是在转色后15 d，为11.74，之后随着果实成熟，mDP值持续增加。在本研究的最后一个采样点转色后67 d，可溶性和非可溶性PA的mDP分别为7.45和16.87。

2.4 种子表皮颜色参数的变化

利用分光测色计测定不同发育时期葡萄种子表皮的颜色值L*、a*、b*，分析其表皮颜色参数的变化，并绘制色卡图，结果如图5所示，种子表皮由果实转色前15 d的深绿色到转色的浅绿色，转色后6 d‘赤霞珠’种子表皮开始转为浅棕色，接着为红棕色，颜色不断加深。

图5 果实发育过程中种子外观、表皮色卡及其L＊、a＊、b＊值的变化Figure 5 Variation of seed appearance, coat epidermal color and L*, a*and b* values during berry

L*表示种子色彩明度，随颜色增亮而增大。在本研究中，种子表皮的L*值从果实转色开始逐渐下降，说明种子表皮的颜色是不断变暗加深的。a*为正值时，代表颜色偏向红色，为负值则代表颜色偏向绿色。从图5可见，在种子发育过程中，a*值由负变正，并逐渐升高，说明种子表皮的颜色是由绿色色调变为红色色调，且红色色调不断增加；而b*为正值则代表颜色偏向黄色，为负值则代表颜色偏向蓝色，该研究结果表明，b*值随种子成熟其正值减少，表示黄色色调不断减少。

2.5 种子表皮颜色与PA含量的相关性

对种子表面颜色相关参数及可溶性和非可溶性PA含量进行相关性分析，如表4所示。在葡萄种子发育过程中，可溶性PA和色角度呈极显著正相关，与其它参数相关性不明显。而非可溶性PA含量与L*值、b*值和饱和度呈极显著负相关，与a*值、色泽比和色光值呈极显著正相关，相似的相关关系也体现在非可溶性PA含量占比与各颜色参数之间、非可溶性PA占比与L*值、b*值和饱和度之间呈现显著负相关，而与a*值、色泽比和色光值呈现显著正相关性。在所有的表面颜色与PA含量之间的相关性中，非可溶性PA含量与色泽比的相关性系数最高，达到0.877。这些结果表明，在‘赤霞珠’种子的发育过程中，聚合度较大的非可溶性PA与种子表面颜色相关的L*、a*、b*、色泽比、色光值、色角度相关性都很强，可以用这些参数反映种子PA的含量状况。

表4 果实发育过程中种子表面颜色参数与PA间的相关性Table 4 Correlation coefficients between the coat color parameters and PA in the seeds during berrydevelopment.

分别将种子可溶性和非可溶性PA含量、非可溶性PA含量占比作为因变量，L*、a*、b*、色泽比H、色光值s、色角度h、饱和度C作为自变量，进行多元线性回归分析，结果如表5所示。

表5 不同发育时期‘赤霞珠’种子PA与表皮颜色的多元回归方程Figure 5 The regression equation of PA and seeds coat color of 'Cabernet Sauvignon' in different developmental stages

PA含量与种子表面颜色参数拟合建立的多元回归方程，相关系数（r）在0.935～0.947，表明拟合程度较好。其中非可溶性PA含量与表面颜色的回归方程相关系数最大，达到0.947，表明该多元回归方程可以充分反映不同发育时期‘赤霞珠’种子的PA含量。

3 讨论与结论

单宁在决定葡萄酒收敛性、颜色稳定和陈酿潜力等方面起着重要作用。本研究表明，在‘赤霞珠’果实转色之后种子中可溶性PA逐渐减少，而非可溶性PA相应增加，由于种子中可溶性PA含量显著高于非可溶性PA，其结果就是随种子成熟PA含量减少，这与前人研究结果相似。许多研究发现，葡萄成熟过程中，果皮单宁含量增加，种子单宁含量减少[17]，并且认为这与种子中单宁氧化并逐渐形成种衣有关[18-19]。

PA溶解度的差异也反映了其聚合度的高低，可溶性PA有相对较低的聚合度，而非可溶性PA有较高的聚合度，在种子发育过程中这些非可溶性PA会与细胞壁蛋白、多糖等细胞成分发生氧化交联，造成溶解度降低[20]。在葡萄酒酿造过程中相对于非可溶性PA，可溶性PA的浸提率相对较高，因此，其对葡萄酒感官质量的影响相对较大。但另一方面，PA的收敛性强弱又与聚合度、分子结构密切相关，根据本研究结果，‘赤霞珠’种子中可溶性PA的mDP值在6.50～10.71，而非可溶性PA的mDP值在10.84～45.78。一般认为，只有聚合度＜20的PA可浸提至葡萄酒中[21]，低聚合度的PA会贡献苦味，而高聚合度PA会贡献涩味；随着 PA聚合度增加，涩感的最大强度（maximun intensity, Imax）增加，同时苦味的Imax和总延续时长（total duration）下降[22]。因此认为随种子成熟，高聚合度的PA增加而低聚合度的PA减少，有利于减轻所酿葡萄酒的苦味，在一定程度上增加涩感和丰满度。

除了聚合度之外，PA组成单元的没食子酯化率也与葡萄酒的涩感强度呈显著的正相关[21]，具有较高的没食子酯化率的单宁会有“令人不愉悦”的涩感，表现出干燥、粗糙以及颗粒感[23]。本研究表明，随着种子成熟，游离的ECG显著降低，且非可溶性PA中ECG呈现增加的趋势，这暗示着种子的充分成熟，会使可浸出的ECG减少，间接地对所酿造的葡萄酒感官品质有正面作用。选择合适的采收时间，可以为葡萄酒酿造提供优质的种子PA。

PA是植物色素成分，在拟南芥、小麦和油菜等植物的种皮以及棕色棉纤维中积累，氧化后形成棕色色素[24]。在葡萄种子中PA主要分布在表皮，在成熟过程中，种子的变色原因之一被认为是酚类物质的氧化。根据本研究的结果，种子表皮颜色相关的参数与种子PA的含量具有显著的相关性，可以通过种子表面颜色的L*值、a*值、b*值、色泽比H、色光值s、色角度h和饱和度C做多元回归线性方程，来反映出种子PA的含量。酿酒葡萄种子在采收过程中，可以利用L*、a*、b*颜色模型对种子PA的含量和成熟度进行快速判断。本研究只初步证明种子表皮颜色与PA含量之间有相关性，但具体的合成机理仍然需要进一步确定。