基于UPLC-Q-Exactive-MS技术鉴定蒙药荜茇的化学成分

张弘，张慧文，张晨，刘宏，许佳绮，王焕芸（内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110）

荜茇又名荜拔、毕勃、荜拨梨，为胡椒科植物荜茇PiperlongumL.的干燥近成熟或成熟果穗，收载于历版《中国药典》。国内主产于云南、两广地区，国外主产于印度尼西亚、菲律宾、越南。荜茇是药食两用中药[1]，蒙医体系中也常见它的身影，但中药学和蒙药学对荜茇的药性认识和临床应用不尽相同，范围亦有差异[2]。目前临床上主要用于脘腹冷痛，呕吐，泄泻，寒凝气滞，胸痹心痛，头痛，牙痛。现代植物化学研究表明，荜茇中含有的化学成分以生物碱类和挥发油类成分为主[3]，同时含有少量黄酮类、有机酸类、萜类和甾醇类、氨基酸类以及微量无机元素等成分，其中酰胺类化合物为荜茇的主要特征成分。荜茇的药理活性报道较多，但最新的研究侧重于抗肿瘤、降脂、抗菌抗炎、抗抑郁和抗氧化等方面的作用[4]。

荜茇的化学成分复杂，阐述其化学成分的文献很少，且研究方法相对单一。因此，全面且快速鉴定荜茇的化学成分很有必要。近年来，液质联用技术因其简便、快捷与准确等特点常应用于中药化学成分的分离鉴定中。因此本试验采用UPLC-Q-Exactive-MS技术对荜茇化学成分进行分析，旨在探求其发挥药效的物质基础，为其进一步研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

Q-Exactive 高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪、UltiMate 3000 超高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；AB 135-S 型十万分之一分析天平（瑞士Metter Toledo公司）；CF1524R高速冷冻型微量离心机（美国SCILOGEX）；KQ-250 DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WH-1微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂）；FDU2110型冷冻干燥机（东京理化器械株式会社）。

1.2 试药

甲醇（色谱纯，Thermo公司）；水为超纯水。荜茇（内蒙古腾翔中药饮片有限公司，批号：170701，产地内蒙古，经内蒙古医科大学药学院生药学教研室张慧文博士鉴定，均符合2020年版《中国药典》一部规定）。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

取荜茇药材，粉碎过40目筛，称取200 g荜茇粉末，甲醇超声提取3次，每次1 h，合并提取液，减压浓缩后，冷冻干燥制成荜茇冻干粉。精密称取荜茇冻干粉1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，称定重量，超声（功率100 W）处理20 min，放冷后补重，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液即得荜茇供试品溶液。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱条件 Welch Ultimate C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）色谱柱；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，55%A，5～25 min，55%～90%A，25～50 min，90%～100%A）；流速1 mL·min-1；检测波长272 nm；柱温30℃；进样量20 μL。

2.2.2 质谱条件 质谱条件：离子源为HESI源；正、负离子模式同时检测；正离子检测模式下，辅助气体辅助气体体积流量30 L·min-1，喷雾电压4.00 kV，离子传输管温度300℃，辅助气温度100℃，碰撞能量（CE）45 eV；负离子模式下，辅助气体体积流量30 L·min-1，喷雾电压3.5 kV，离子传输管温度300℃，辅助气温度100℃，CE为30 eV，检测方式均为Full-MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，扫描范围m/z110～1000。

2.3 荜茇数据库的建立与分析鉴定

通过Compound Discoverer 3.0软件对所检测样本的质谱数据进行自动初步筛查，再查阅Chemspider数据库和荜茇化学成分的相关中英文文献，收集整理荜茇中已报道的化合物，将各化学成分进行汇总，包括分子式、分子结构式、相对分子质量、分子离子、药材来源、中英文名称等，采用Xcalibur3.0软件进行峰提取、峰匹配等质谱数据处理方法，质谱偏差范围δ≤5×10-6，对目标化合物进行准确鉴定，结合已有文献信息[3，5-13]推测可能的化合物的裂解规律并进行初步分析鉴定。

3 结果与讨论

3.1 荜茇药材的UPLC-Q-Exactive-MS/MS鉴定

正、负离子模式下荜茇的总离子流图如图1所示。通过参考相关文献、对比保留时间、精确质谱信息等，对荜茇的化学成分进行确认，鉴定出57个可能的化学成分，包括16个A型酰胺类生物碱、13个B型酰胺类生物碱、9个C型酰胺类生物碱、10个D型酰胺类生物碱、3个E型酰胺类生物碱、6个O型化合物（4个酰胺化合物、1个羧酸、1个酯类化合物）。UPLC-Q-Exactive-MS/MS数据见表1。

图1 正离子模式（A）和负离子模式（B）下荜茇的总离子流图Fig 1 Total ion flow chromatogram of Piperlongum L. in the positive（A）and negative ion mode（B）

表1 荜茇化学成分结构鉴定Tab 1 Structure identification of chemical components in Piperlongum L.

续表1

续表1

3.2 成分鉴定过程

荜茇中的生物碱由不同的脂肪酸和胺部分组成，其中脂肪酸部分的差异集中在末端结构（亚甲二氧基苯基和正戊基）；胺部分由哌啶、异丁胺或吡咯组成。根据构成生物碱的两部分之间的差异可以将生物碱分为6类，分别为Type A、Type B、Type C、Type D、Type E、Type O型，Type A～E型结构见图2。其中，Type O型为其他化合物。鉴于相似结构具有相同的裂解规律，选择Type A型和Type C型两类成分进行详细说明。

图2 Type A～E型结构Fig 2 Structure of type A～E

3.2.1 Type A型 Type A型结构为吡啶结合末端带有亚甲二氧基苯的不饱和脂肪酸，其质谱裂解特点为胺部分容易失去一个中性哌啶（C5H11N，85.0886 Da）或甲酰基哌啶（C6H11NO，113.0835 Da），其末端结构易产生m/z161.0597[C10H8O2+H]+的丙烯基亚甲二氧基苯和m/z135.0440[C8H6O2+H]+的甲基亚甲二氧基苯，共发现16个A型酰胺类生物碱。以胡椒碱为例来说明鉴别过程。胡椒碱可能的裂解规律见图3，二级质谱图见图4。在正离子模式下检测到m/z286.1449[M+H]+的分子离子峰，丢失C5H11N形成m/z201.0554的碎片离子，再丢失CO形成m/z173.0603的离子碎片，以及脂肪酸末端产生的m/z161.0604[C10H8O2+H]+的丙烯基亚甲二氧基苯和m/z135.0446[C8H6O2+H]+的甲基亚甲二氧基苯。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及比对结果，确认化合物为胡椒碱[8]。

图3 胡椒碱的质谱裂解途径Fig 3 Fragmentation pathway of piperine

图4 胡椒碱的二级质谱图Fig 4 MS/MS spectrum of piperine

3.2.2 Type B型 Type B型结构为异丁胺结合末端带有亚甲二氧基苯的不饱和脂肪酸，与Type A型结构相比，其质谱裂解特点为胺部分容易失去1个中性异丁胺（C4H11N，73.0886 Da）或甲酰基异丁胺（C5H11NO，101.0835 Da），其末端结构的裂解模式与Type A型相同，共发现13个B型酰胺类生物碱。3.2.3 Type C型 Type C型结构为异丁胺结合末端结构为正戊基的不饱和脂肪酸，其质谱裂解特点为胺部分容易失去1个中性异丁胺（C4H11N，73.0886 Da），有时会伴随脱羰基（CO，27.9943 Da），也会产生一系列烷基碎片（并不是特征碎片），结构中有共轭双键，易发生α裂解脱烷基，共发现9个C型酰胺类生物碱。以N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide为例来说明鉴别过程。N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide可能的裂解规律见图5，二级质谱图见图6。在正离子模式下检测到m/z252.2334 [M+H]+的分子离子峰，丢失C4H8形成m/z196.1706的碎片离子，再丢失NH3形成m/z179.1439的离子碎片，脂肪酸部分经过α裂解丢失C6H12后产生m/z168.1386[C10H17NO+H]+的碎片离子。结合化合物的分子式、裂解规律、碎片信息及比对结果，确认化合物为N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide[8]。

图5 N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide的质谱裂解途径Fig 5 Fragmentation pathway of N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide

图6 N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide的二级质谱图Fig 6 MS/MS spectrum of N-isobutyl-（2E，4E）-dodecadienamide

3.2.4 Type D型 Type D型结构为哌啶结合末端结构为正戊基的不饱和脂肪酸，与Type C型结构相比，其质谱裂解特点为胺部分容易失去1个中性哌啶（C5H11N，85.0886 Da），有时会伴随脱羰基（CO，27.9943 Da），结构中有共轭双键，则易发生α裂解脱烷基，共发现10个D型酰胺类生物碱。

3.2.5 Type E型 Type E型结构为吡咯烷结合末端带有苯并二氧杂环的不饱和脂肪酸，与Type A型结构相比，此类结构中胺部分容易失去1个中性吡咯（C4H9N，71.0729 Da）或甲酰基吡咯（C5H9NO，99.0678 Da），其末端结构的裂解模式与Type A型相同，共发现3个E型酰胺类生物碱。

3.2.6 Type O型 除Type A～E外的结构统称为O型结构，共发现6个O型化合物（4个酰胺化合物、1个羧酸、1个酯类化合物）。O型化合物的裂解规律基本相似，易在碳碳单键与碳碳双键间裂解，区别主要在官能团上。酰胺类化合物易失去哌啶，后继续丢失一分子CO；而环内酰胺则易失去CO；羧酸易先失去一分子羟基，进一步失去CO；酯类化合物先失去烷氧基后，又失去CO。此外，甲氧基也容易离去。O型化合物可能的质谱裂解途径见图7。

图7 O型化合物的质谱裂解途径Fig 7 Fragmentation pathway of type O compounds

4 结论

本试验以甲醇为提取溶剂，分别考察了荜茇回流和超声两种提取方式对提取的影响，结果发现超声提取的峰容量更大，提取更完全；本试验还考察了流动相中甲酸的含量对提取的影响，当不加入甲酸时，以胡椒碱为代表的生物碱类成分出现峰分离度低及拖尾等现象，为避免此类现象发生，选用了甲醇-0.1%甲酸水为流动相。

本文建立了一种基于UPLC-Q-Exactive-MS技术的快速、灵敏、可靠的鉴定荜茇化学成分的方法，目的是探求该中药发挥药效的物质基础，为后续课题组进行药物代谢动力学和药效学研究提供参考，从而更好地研究其作用机制。