LC-MS/MS法测定人血浆中比阿培南浓度

钱亚芳，杨旭萍，蒋艳，胡楠（常州市第一人民医院药学部，江苏 常州 213003）

碳青霉烯类药物在重症感染治疗中有举足轻重的地位，是革兰氏阴性杆菌治疗的最后一道防线[1]。比阿培南属于碳青霉烯类抗菌药物，相较于其他品种，具有稳定性更好、耐药性更小的优势[2]，其抗菌活性和美罗培南相当，神经毒性和肾毒性小，更加安全有效[3]，临床上常作为治疗重症感染的杀手锏[2]。比阿培南的血药浓度及维持时间是保证其临床效果的关键[2]。比阿培南血药浓度测定已报道的方法多为HPLC法[4-9]，分析效率较低，易受干扰。本研究使用LC-MS/MS技术，建立一种快速、准确地测定比阿培南血药浓度的方法，为其临床合理便用提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Jasper HPLC液相色谱仪、Triple Quad 4500MD三重四极杆串联质谱仪（美国AB SCIEX），Direct-Q纯水仪（美国Millipore），BT25S电子分析天平（德国Sartorius），5417R低温高速离心机（德国Eppendorf），Vortex-Genie 2涡旋混合器（美国Scientific industries）。

1.2 待测药品

对照品比阿培南（批号：130578-201602，纯度：99.0%）、法罗培南（内标，批号：130532-201301，纯度：80.3%）（中国食品药品检定研究院）。乙腈（色谱纯，Merck公司），水由Milli-Q超纯水系统制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex HILIC柱（2.1 mm×50 mm，2.6 μm，Phenomenex，USA）；柱温：40℃；流动相：0.1%甲酸-水（含10 mmol·L-1乙酸铵）（A）和95%乙腈-水（含10 mmol·L-1乙酸铵）（B），梯度洗脱（0.01～0.70 min：95%B，0.70～1.00 min：95%～40%B，1.00～2.50 min：40%B，2.50～2.70 min：40%～95%B，2.70～5.00 min：95%B）；流速：0.4 mL·min-1；进样量：5 μL；分析时间：5 min。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），正离子多反应监测（MRM）模式扫描，毛细管电压（IS）为5500 V，离子源温度（TEM）为550℃，气帘气（CUR）为30 psi，碰撞气（CAD）为8 psi，雾化气（GS1）为50 psi，辅助气（GS2）为50 psi。比阿培南和内标（法罗培南）的MS-scan图见图1，各自的监测离子对、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）等质谱参数见表1。

表1 比阿培南和内标LC-MS/MS 测定参数Tab 1 LC-MS/MS measurement parameters of the biapenem and internal standard

图1 比阿培南和内标（法罗培南）的MS-scan图Fig 1 MS-scan image of biapenem and internal standard（faropenem）

2.3 溶液配制

精密称取比阿培南对照品适量，用甲醇定量配制成15.00 mg·mL-1的对照品储备液，置于-20℃冰箱中保存，使用前用甲醇稀释成2.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00、400.00、500.00 μg·mL-1的系列对照品工作液。

精密称取法罗培南对照品适量，用甲醇-水溶液（4∶1）配制成5.00 mg·mL-1的内标储备液，置于-20℃冰箱中保存，临用前用甲醇-水溶液（4∶1）稀释成10.00 μg·mL-1的内标工作液。

2.4 血浆样品的处理

精密移取血浆样品50 μL（含5 μL标准工作液和45 μL空白血浆）于离心管中，加入内标工作液（10.00 μg·mL-1）5 μL，加入乙腈150 μL沉淀蛋白，涡旋3 min，于16 400 r·min-1离心10 min，精密移取上清液20 μL至另一离心管中，加入180 μL乙腈-水溶液（95∶5）稀释，置于进样小瓶中，按“2.1”和“2.2”项下方法进样测定。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性 取6 份不同来源的人空白血浆、加入对照品的血浆样品（质量浓度为0.2 μg·mL-1和2 μg·mL-1）、使用比阿培南的患者血浆样品按“2.4”项下方法处理分析。结果比阿培南和法罗培南的保留时间分别为1.94 min和0.98 min，见图2。

图2 血浆中比阿培南和法罗培南的LC-MS/MS 色谱图Fig 2 LC-MS/MS chromatogram of biapenem and faropenem in the plasma

2.5.2 标准曲线 向空白血浆中分别加入“2.3”项下的系列对照品工作液，配制成0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg·mL-1的对照品血浆样本，按“2.4”项下方法处理后进样分析。

以比阿培南的浓度（X）为横坐标，比阿培南与内标的峰面积比值（Y）为纵坐标，进行回归分析（W＝1/X2），得到标准曲线回归方程：Y＝1.460X-0.0177（r＝0.9959），r≥0.9950，结果说明在本研究条件下血浆中比阿培南在0.20～50.00 μg·mL-1与峰面积线性关系良好。

2.5.3 精密度与准确度 向空白血浆中分别加入“2.3”项下质量浓度为5.00、50.00、400.00 μg·mL-1的对照品工作液，配制成低、中、高3个浓度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的质控样本，每6份为1个分析批，按“2.4”项下方法处理后进样分析，根据随行标准曲线，计算质控样本的准确度和批内精密度。在2周内对3个分析批质控样本进行检测分析，计算质控样本的准确度和批间精密度，结果见表2。

表2 比阿培南血药浓度测定的准确度和精密度结果Tab 2 Accuracy and precision of biapenem

本研究方法下，比阿培南血药浓度测定的准确度为97.80%～111.25%，低、中、高3个浓度水平质控样本的精密度RSD＜15%，均符合生物样本定量分析的要求。

2.5.4 提取回收率和基质效应 取“2.5.3”项下低、中、高3个质量浓度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的质控样本，每个浓度水平6 份，按“2.4”项下方法处理后进行分析，得到比阿培南的峰面积A1；另取人空白血浆，乙腈沉淀蛋白后取得上清液，向上清液中加入分别加入“2.3”项下质量浓度为5.00、50.00、400.00 μg·mL-1的对照品工作液，配制成低、中、高3个质量浓度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的样本，每个浓度水平6份，分析后得到比阿培南的峰面积A2，峰面积比A1/A2即为比阿培南的提取回收率。结果见表3，本研究方法下，比阿培南的提取回收率为80.25%～84.11%（RSD＜15%），说明本样品前处理方法适用于比阿培南的提取分析。

以纯水作为基质，配制低、中、高3个质量浓度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的样本，每个浓度水平6份，进样分析得到比阿培南的峰面积A3。根据峰面积比A2/A3求算比阿培南的基质效应。结果见表3，比阿培南的基质效应结果为109.19%～117.91%（RSD＜15%），表明基质中内源性物质对比阿培南的影响较小。

表3 人血浆样本中比阿培南提取回收率和基质效应结果Tab 3 Extraction recovery and matrix effect of biapenem

2.5.5 稳定性考察 取低、中、高3个质量浓度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的质控样本，分别于室温放置1 h，4℃冰箱放置6 h，-80℃冰箱放置14 d以及经过3次冻融循环后，按“2.4”项下方法处理后进样分析，考察样本在上述4种条件下的稳定性。

另取低、中、高3个质量浓度水平（0.50、5.00、40.00 μg·mL-1）的质控样本，按“2.4”项下方法处理，将处理好的样本于自动进样器（15℃）中放置6 h 后分析，考察处理后样本在自动进样器中的稳定性。

稳定性考察结果见表4，在上述5种不同条件下，低、中、高3个浓度水平的测定值与理论值的平均偏差均在±15%范围内，表明人血浆中比阿培南在本实验条件下稳定。

表4 人血浆样本中比阿培南测定的稳定性结果Tab 4 Stability of biapenem

2.6 临床应用

应用本方法对15例发生感染并使用比阿培南的患者进行血药浓度测定，其中男性11例，女性4例，年龄47～92岁。具体用药方案为比阿培南0.3 g ivgtt q8h或0.3 g ivgtt q6h，连续给药3～4次，于第4次给药前抽取患者静脉血，离心后得到患者血浆，按“2.4”项下方法处理后进样分析得到患者谷浓度，结果见表5，测得比阿培南谷浓度为0.30～11.82 μg·mL-1，可为临床合理化用药提供重要依据。

表5 患者感染灶、用药方案和谷浓度检测结果Tab 5 Infection condition，therapeutic regimen and results of trough concentration determination of patients

3 讨论

在临床实际的抗感染治疗中，使用碳青霉烯类药物的患者病情多较为严重，且联用药物较多。不同品种的碳青霉烯类药物药效学和药动学方面均存在一定差异，不同病理生理状态也会影响其药动学[10]。碳青霉烯类血药谷浓度是否达到目标范围，可用于优化给药方案，提高抗感染治疗的有效性和安全性[10]。比阿培南具有抗菌谱广、抗菌活性强、临床效果好等特点，其对耐药的铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌有一定优势，且无中枢神经系统毒性，不会诱发癫痫发作[11]。

比阿培南是新一代碳青霉烯类抗菌药物[1]，检索现有文献，已报道的比阿培南血药浓度测定方法多为HPLC法[4-9]，分析效率低，易受干扰。本研究建立的LC-MS/MS分析方法，相较于已报道的HPLC法[4-9]，专属性更强，分析效率得到显著提高，能满足大批量样本分析的要求。本研究考察了C18柱以及HILIC柱，在研究初期尝试使用C18柱对比阿培南进行分离，发现比阿培南在C18柱上保留不佳，与比阿培南极性较大、亲水性较好有关。HILIC 柱采用两性离子修饰的固定相，相较于C18柱，更适用于极性和亲水性化合物的分析[12]。本研究最终使用了HILIC柱对比阿培南和内标（法罗培南）进行了分离和测定，两种物质得到了很好的保留和分离。通过调整流动相比例以及梯度洗脱程序改善峰形，降低了干扰。

比阿培南的国内药品说明书中适应证描述简单，用法用量保守，限制了其临床应用[11]。比阿培南的主要排泄途径为肾脏排泄，患者肾脏功能、血流动力学、液体复苏、CRRT等体外循环支持等因素均会影响比阿培南的血药浓度[10]。重症患者联合用药较多，发生药物相互作用的机会增加，也会对比阿培南的血药浓度产生影响。监测比阿培南的谷浓度可以比较直接地验证是否在目标范围内，实现个体化给药，提高治疗的有效性和安全性[10]。有文献报道，1～5 μg·mL-1为比阿培南的谷浓度目标范围[8]。在本研究中，有4例患者谷浓度低于1 μg·mL-1，将此结果反馈至临床，临床考虑此4例患者抗感染效果不佳，换用亚胺培南西司他丁或美罗培南；1例患者谷浓度高于5 μg·mL-1，将此情况反馈至临床，建议将比阿培南给药剂量调整为0.3 g ivgtt q12 h；10例患者的比阿培南谷浓度在1～5 μg·mL-1，临床治疗有效，病程中患者未出现不良反应。

本研究建立的LC-MS/MS分析方法，专属性强，准确度和重现性好，分析效率高，适用于比阿培南的临床治疗药物监测。