Box-Behnken设计-响应面法优化经典名方散偏汤的提取工艺

孙萌，刘雪纯，赵玥瑛，张晴，席铖，董爽，张馨雨，杜守颖，白洁，陆洋（北京中医药大学 中药学院，北京 102488）

散偏汤为国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》中的第98方，为治头痛要方，出自清代陈士铎所著的《辨证录》[1]头痛门卷之二，由川芎、白芍、白芥子、甘草、郁李仁、白芷、香附、柴胡8味药组成，功效为疏肝解郁、祛风止痛，用于治疗郁气不宣，风邪袭于少阳经之半边头风。方中川芎为君药，外散风邪，入肝胆经，善治头痛；白芍和甘草合用酸甘化阴、缓急止痛，柴胡和香附合用疏利肝胆、和解少阳，白芷解表散寒、祛风止痛，白芥子温肺化痰、通络止痛，以上6味共为臣药；郁李仁药性主降，助川芎散之太过，为佐药；甘草为使药，可调和诸药。现代临床报道散偏汤可用于治疗血管神经型偏头痛、急性缺血性中风偏瘫、抑郁症、多囊卵巢综合征等疾病[2-5]。散偏汤传统剂型为汤剂，需要临时煎煮，费时费力，且不易保存[6]，将其开发成颗粒剂能够克服以上缺点，同时亦能保证其药性、药效，在临床应用上具有重要意义。

根据经典名方颗粒剂开发研究的相关文件，颗粒剂的关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）应与基准样品保持一致，CQAs包括指纹图谱相似度、指标性成分含量以及出膏率。经典名方颗粒剂的工艺研究并非以CQAs最高为目的，而是要保证颗粒剂的CQAs与基准样品的质量标准范围具有较好的一致性，这就给经典名方颗粒剂的工艺研究带来了挑战。Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）采用多元回归方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，针对目标工艺水平进行工艺参数的预测和优化[7-10]，该方法能够有效解决经典名方颗粒剂工艺研究面临的困难。为保证提取液的CQAs能够达到散偏汤基准样品的质量标准范围，本研究依据前期确定的基准样品标准[11]选取阿魏酸、芥子碱硫氰酸盐、甘草苷和甘草酸含量以及出膏率为综合评分的指标，采取Box-Behnken设计-响应面法优化提取工艺参数。

1 仪器与试药

1.1 仪器

JM-B10002电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司）；赛多利斯BSA224S电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；HH-6型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康达圣科技有限公司）；DZ47SD20型真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；G20型医用离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；LC-20A高效液相色谱仪（DAD检测器，四元低压梯度泵，柱温箱，自动进样器，LC Solution色谱工作站）[岛津（中国）有限公司]；Thermo UItimate3000高效液相色谱仪（DAD检测器，CM7.2色谱工作站）[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.2 试药

阿魏酸（批号：110773-201915，含量：99.0%）、芥子碱硫氰酸盐（批号：111702-202006，含量：98.3%）、甘草苷（批号：111610-201908，含量：93.1%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，含量：97.7%）（中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher公司，色谱纯）；乙醇（分析纯）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

川芎饮片（批号：2009072，产地四川眉山）、白芍饮片（批号：200623，产地安徽亳州）、白芥子饮片（批号：200213，产地四川南充）、甘草饮片（批号：201804-3，产地甘肃武威）、柴胡饮片（批号：TS-4，产地甘肃康乐）、郁李仁饮片（批号：160944，产地甘肃天水）、白芷饮片（批号：201801-4，产地四川遂宁）、香附饮片（批号：2009080，产地河南开封）（亿帆医药股份有限公司提供，经北京中医药大学刘春生教授鉴定）。

2 方法与结果

2.1 散偏汤基准样品的制备

取处方量饮片（川芎38 g，白芍19 g，白芥子11 g，甘草4 g，柴胡4 g，郁李仁4 g，白芷2 g，香附8 g）于陶瓷锅中，加水630 mL，放置浸泡30 min，武火（1500 W）煎沸后文火（300 W）煎煮45 min，趁热用1层300目尼龙布过滤；滤渣加水540 mL，武火（1500 W）煎沸后文火（300 W）煎煮35 min，趁热过滤，合并两次滤液，冷却，调整体积至600 mL，即得散偏汤水煎液。精密移取散偏汤水煎液10 mL于30 mL西林瓶中，冰箱-20℃预冷冻12 h左右，转移至-80℃的真空冻干机（真空度为＜10 Pa）冻干72 h，取出后压盖密塞，即得散偏汤基准样品。

2.2 指标性成分含量测定方法

2.2.1 色谱条件

① 色谱条件1：色谱柱：Waters Xselect HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脱（0～10 min，2%乙腈；10～18 min，2%～6%乙腈；18～45 min，6%～10%乙腈；45～90 min，10%～15%乙腈；90～110 min，15%～95%乙腈）；柱温：30℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；波长：321 nm，用于阿魏酸和芥子碱硫氰酸盐的含量测定。

② 色谱条件2：色谱柱：资生堂CAPCELLPAKC18MGS5（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脱（0～8 min，19%～20%乙腈；8～20 min，20%～33%乙腈；20～40 min，33%～50%乙腈；40～45 min，50%～100%乙腈；45～49 min，100%～19%乙腈）；柱温：30℃；流速：1 mL·min-1；进样量：10 μL；波长：237 nm，用于甘草苷和甘草酸的含量测定。

2.2.2 方法学考察[11]根据《中国药典》2020年版方法[12]，按照“2.2.1”项下色谱条件对含量测定方法进行方法学考察，结果见表1，各考察指标均符合要求。

表1 散偏汤中指标性成分含量测定的方法学考察Tab 1 Methodological investigation on the content determination of index component in the Sanpian decoction

2.2.3 供试品溶液的制备

① 基准样品：取散偏汤基准样品2份，于西林瓶中加适量水超声（250 W，40 kHz）溶解，转移至10 mL量瓶中，定容至刻度，混匀后取5 mL于离心管，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，即得基准样品供试品溶液。

② 提取液：称取处方量饮片于圆底烧瓶中，加适量水，放置浸泡30 min，回流一段时间，用1层300目的尼龙布趁热过滤，冷却；调整滤液体积一致，取5 mL于离心管中，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得提取液供试品溶液。

2.2.4 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品9.50 mg于10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，得到940.50 μg·mL-1的阿魏酸对照品母液，用70%甲醇稀释成47.03 μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液。精密称取芥子碱硫氰酸盐对照品9.85 mg于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得到968.26 μg·mL-1的芥子碱硫氰酸盐对照品母液，用甲醇稀释成96.83 μg·mL-1的芥子碱硫氰酸盐对照品溶液。

分别精密称取甘草苷对照品9.69 mg、甘草酸铵对照品10.05 mg于10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，分别得到902.14 μg·mL-1、1002.21 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸对照品母液，用70%乙醇稀释，分别得到90.21 μg·mL-1、96.20 μg·mL-1的甘草苷、甘草酸对照品溶液。

2.3 出膏率测定

2.3.1 基准样品出膏率的测定 按“2.1”项下方法制备基准样品，移取水煎液200 mL至蒸发皿中，置于水浴锅上浓缩至稠膏状，60℃真空干燥72 h，即得散偏汤基准样品干膏，按照公式（1）计算得出膏率；出膏率（%）＝（所得干膏重×水煎液总体积）/（药味称样量×取样体积）×100% （1）

2.3.2 提取液出膏率的测定 将供试品制备后剩余的药液转移至蒸发皿中，浓缩至适当体积后，置于水浴锅上浓缩至稠膏状，60℃真空干燥72 h，按照公式（1）计算得出膏率。

2.4 单因素试验

2.4.1 加水倍量的考察 称取处方量饮片于圆底烧瓶中，分别加入散偏汤处方量饮片5倍（450 mL）、10倍（900 mL）、15倍（1350 mL）、20倍（1800 mL）水，放置浸泡30 min，回流提取80 min，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行两份，测定并取平均值。

结果见图1，由图1可知，4种指标性成分的含量及出膏率均随加水倍量的增加而增加，在5倍量时最低，20倍量时最高，15倍到20倍变化不明显，总体呈现一个向上的趋势。高于20倍的加水量对指标性成分含量及出膏率提高作用不明显，为避免资源浪费，不再选择更高的加水倍量，选择5倍加水量为低水平，20倍加水量为高水平。

图1 不同加水倍量下各指标性成分含量（A）及出膏率（B）（n＝2）Fig 1 Content of each index component（A）and extract yield（B）at different water times（n＝2）

2.4.2 提取时间的考察 称取处方量散偏汤饮片于圆底烧瓶中，加入处方量13倍量（1170 mL）水浸泡30 min，分别回流提取时60、90、120、150 min，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，平行两份，测定并取平均值。

结果见图2，由图2可知，出膏率在60 min时最低，150 min时最高，总体呈现一个向上的趋势。4个指标性成分含量特别是芥子碱硫氰酸盐和甘草苷的含量，随着提取时间总体上变化不大，除阿魏酸外，其他3种指标性成分含量均在90 min时有最高值，而阿魏酸含量则与提取时间成正相关。阿魏酸不稳定，浓缩、干燥过程中损失率最大，甘草酸损失率最小，所以虽然甘草酸在150 min含量最低，但为最大程度保证提取液中指标性成分的含量，故选择60 min为低水平，150 min为高水平。

图2 不同提取时间下各指标性成分含量（A）及出膏率（B）（n＝2）Fig 2 Contents of each index components（A）and extract yield（B）at different extraction time（n＝2）

2.5 Box-Behnken设计-响应面法优化散偏汤提取工艺

2.5.1 因素水平设计 选取提取时间A（60 min、105 min、150 min），加水倍量B（5倍、12.5倍、20倍），提取次数C（1次、2次、3次）三因素进行响应面试验设计。以4个指标性成分含量（Y1：阿魏酸含量；Y2：芥子碱硫氰酸盐含量；Y3：甘草苷含量；Y4：甘草酸含量）和出膏率（Y5）为评价指标，采用Design Expert 10.0软件进行响应面设计和数据分析，筛选出最佳提取工艺。

前期试验中发现，在“提取-浓缩-干燥”过程中，4个指标性成分均有一定损失，阿魏酸损失率约为40%，芥子碱硫氰酸盐损失率约为25%，甘草苷损失率约为20%，甘草酸损失率约为5%。因此，选取各指标性成分含量及出膏率作为评价指标进行综合加权评分，设置权重系数均为0.2，同时将各成分损失率折算，进行综合评分，综合评分值越接近0则越接近基准样品要求。综合评分公式如下：

综合评分＝0.2×（提取液中阿魏酸含量-1.40×基准样品中阿魏酸含量）+0.2×（提取液中芥子碱硫氰酸盐含量-1.25×基准样品中芥子碱硫氰酸盐含量）+0.2×（提取液中甘草苷含量-1.20×基准样品中甘草苷含量）+0.2×（提取液中甘草酸含量-1.05×基准样品中甘草酸含量）+0.2×（提取液出膏率-基准样品出膏率）（2）

根据Design Expert 10.0软件进行三因素三水平的17次试验，其中12个析因点，5个中心点，因素水平表见表2，试验设计见表3，结果见表4。

表2 响应面试验设计因素水平表Tab 2 Factor and level of response surface methodology

表3 Box-Behnken设计-响应面法试验设计Tab 3 Box-Behnken design-response surface methodology

表4 响应面试验结果Tab 4 Response surface methodology

2.5.2 模型建立与评价 根据17组试验结果，采用二项式回归对综合评分及对应的因素（提取时间、加水倍量、提取次数）进行拟合，得到的回归方程：综合评分＝9.19+1.12A+7.99B+11.56C+3.84AB-0.25AC-1.95BC+0.53A2-2.04B2-2.88C2。

对拟合模型进行ANOVA方差分析，结果见表5。该模型的方差P＝0.0001，显著；模型的失拟项P值为0.0589＞0.05，不显著，方差显著而失拟项不显著，表明该模型有统计学意义，且模型与实际值能较好地拟合。模型的相关系数R2＝0.9711，调整决定系数R2adj＝0.9340，说明该模型能解释93.40%响应值的变化，可信度较好，可以运用该模型分析。

表5 方差分析结果Tab 5 Analysis of variance

该模型中，因素B、C的P值均＜0.0001，表明加水倍量、提取次数对综合评分的影响较显著，3个因素对综合评分的影响顺序为提取次数＞加水倍量＞提取时间。此外，根据等高线图和3D图可知，因素A、B、C之间还存在交互作用，具体的响应面分析见图3。3个交互作用中，图3C的响应面图坡度最陡，图3B的次之，图3A的响应面图坡度最平缓，表明加水倍量与提取次数的交互作用最强，对综合评分的影响最大，提取时间与加水倍量的交互作用较弱，对综合评分的影响最小。

图3 各因素交互作用对综合评分影响的响应面图及等高线图Fig 3 Response surface and contour plot of interactive effect on the comprehensive score

2.5.3 预测最优工艺参数 采用Design Expert 10.0软件预测的提取工艺参数为提取时间60.0 min，加水倍量20.0倍，提取次数1.1次，此时的综合评分预测值为0.0。根据实际情况对提取工艺参数进行调整，即加水20倍量（1800 mL）、提取60 min、提取1次。

2.5.4 验证试验 按照调整后的预测工艺参数进行响应面验证试验，结果见表6。

表6 响应面验证试验结果(x±s，n＝3)Tab 6 Verification test of response surface (x±s，n＝3)

3 讨论

经典名方是历代医家临床实践经验的总结，对经典名方的研究和开发既能实现中药剂型现代化创新，也能够推动中医药产业高速发展。经典名方作为体现中药复方配伍理论的重要载体，往往是由多种成分共同作用而起效的，不同的制备工艺参数往往会导致其成分组成和相对含量的变化，因此制备工艺研究是经典名方开发的关键环节。

本研究以单因素试验确定了加水倍量和提取时间的上下限，在单因素试验基础上设计了Box-Behnken设计-响应面法试验，以提取液中4个指标性成分含量及出膏率为指标，通过试验设计及综合加权评分对不同提取条件的结果进行直观分析，优选散偏汤提取工艺，并通过试验验证了优选工艺的可行性。试验发现，不同提取条件下的水煎液的指纹图谱相似度与基准样品标准比均大于0.9，相似度良好，说明不同提取条件下指纹图谱相似度差异不大，故虽然指纹图谱相似度属于CQAs，但在考察提取工艺时未将指纹图谱相似度纳入评分标准。

本研究在散偏汤饮片回流提取之前采取先将饮片浸泡30 min的方法，其原因在于前期研究发现浸泡后4个指标性成分含量相较于不浸泡组均有升高，且前期基准样品的制备也采用了饮片浸泡30 min的方法，基准样品是制剂工艺筛选及制剂标准制订的依据和准绳[13]，为了保持一致性，故在提取工艺的考察部分试验仍继续采用饮片浸泡30 min的方法。

前期考察发现在提取-浓缩-干燥过程中，阿魏酸的损失率高达40%，其原因为阿魏酸以溶液状态存在时不稳定，易受外界和溶液环境等因素的影响，在高温及光照情况下易发生结构变化[14-15]，因此在考察提取时间时充分考虑了阿魏酸损失率高的实际情况，选取阿魏酸含量较高的150 min为高水平。

根据前期试验结果，15批基准样品中，4个指标性成分含量已确定的范围为：每个处方含阿魏酸19.08～35.43 mg，芥子碱硫氰酸盐38.02～70.60 mg，甘草苷14.65～27.21 mg，甘草酸21.17～39.31 mg。试验最终优选散偏汤提取工艺为加水20倍（1800 mL），浸泡30 min，提取60 min，提取1次，根据3组验证试验结果，得到每个处方中阿魏酸含量均值为40.54 mg、芥子碱硫氰酸盐含量均值为70.87 mg、甘草苷含量均值为22.30 mg、甘草酸含量均值为40.63 mg，出膏率均值为23.83%，综合评分为-3.9655，验证试验结果减去“提取-浓缩-干燥”过程的损失，均满足前期建立的质量标准，且与响应面法预测值接近，表明该提取工艺可以用于后续的试验。