鸡粪堆肥中的细菌群落组成及多样性分析

2023-03-31何东贤莫红芳侯小露熊晓妍覃振斌陈孟姣李军成

西南农业学报 2023年1期

何东贤，莫红芳，侯小露，熊晓妍，覃振斌，孙琪，陈孟姣，刘平，李军成

(1.广西农业职业技术大学，南宁 530007；2.华中农业大学，武汉 430000；3.江西农业大学，南昌 330045)

【研究意义】近年来我国畜禽养殖业快速发展趋势明显，但养殖过程中产生的粪便也给我国生态环境保护带来了极大挑战。2020年我国生态环境部、国家统计局和农业农村部等多个部门联合发布的《第二次全国农业污染源普查公报》显示，相较于2010年第一次普查的结果，畜禽养殖业排放的化学需氧量(COD)、总氮(TN)含量和总磷(TP)含量均明显下降[1]，但畜牧养殖的粪污仍是农业污染源的主要来源和成因[2-3]。好氧堆肥是目前常用的畜禽粪污无害化处理及资源再利用手段，其实质是微生物分解和转化有机物的生化代谢过程，微生物群落的代谢能力和菌群结构是影响堆肥效果的关键因素[4-5]。因此，探究鸡粪堆肥过程中细菌群落的构成及演变规律，对深入了解细菌在鸡粪堆肥过程中的作用、提高堆肥效果和防治畜禽养殖污染具有重要意义。【前人研究进展】王秀红等[6]研究证实，不同时间堆肥的微生物群落在碳源代谢能力、细菌菌群种类和丰度上均存在差异。于静等[7]研究表明，温度和pH是影响堆肥菌群变化的主要因素，且厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)在氮素转化和释放过程中发挥重要作用。敖静等[8]的研究进一步表明，堆肥中菌群数量与堆体温度、纤维素酶活性和过氧化氢酶(CAT)活性呈正相关，与脲酶和蛋白酶活性无显著相关性。Chen等[9]研究表明，在猪粪便堆肥中厚壁菌门和变形菌门是占据主导地位的菌门且厚壁菌门中的乳杆菌属(Lactobacillus)细菌能有效降解3-羟基-5-甲基异恶唑(3-MI)，从而有效缓解猪粪便中的异味。已有研究表明，厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门等均为鸡、牛和猪等畜禽动物堆肥中菌群分布的主要菌门[10-11]。邓雯文等[12]探索鸡粪堆肥中重金属的残留、耐药基因与菌群变化情况，发现病原菌属和耐药基因的相对丰度均随着堆肥发酵时间的延续而降低。Cui等[13]研究不同生物炭对鸡粪堆肥过程中细菌菌群变化的影响，结果发现无论是否加入生物炭，厚壁菌门、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门和放线菌门(Actinobacteria)均为占比较高的菌门，但生物炭的加入能有效降低厚壁菌门的相对丰度，这与抗性基因的清除作用密切相关。岳世林等[14]研究表明，细菌和真菌的多样性随着牛粪堆肥过程温度的动态变化而变化，且堆肥过程每个阶段的优势菌群各有不同。苏鹏伟等[15]、岳松涛等[16]的研究也表明，厚壁菌门在堆肥各阶段均为主要类群，而从属水平来看堆肥前期和后期的优势菌群存在明显差异。【本研究切入点】广西属于热带季风气候，高温多雨，是全国畜禽养殖大省和华南地区重要畜禽产品生产供给地，推进畜禽粪便发酵制成有机肥是广西实施污染防治和促进生态农业发展的重大课题。但目前针对广西地区规模化鸡场鸡粪堆肥中菌群变化情况的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究采用高通量测序方法分析广西某规模化鸡场粪便堆肥的细菌群落结构，了解在当地条件下不同发酵阶段堆肥的优势细菌群落，为进一步筛选鸡粪强降解菌种改善堆肥工艺及提高鸡粪堆肥效率以完全清除其潜在病原菌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要堆肥原料为新鲜蛋鸡鸡粪和木糠，均采集于广西某规模化蛋鸡养殖场及其堆肥场。将新鲜鸡粪(不含垫料)与木糠按质量比1∶1混匀后采用条垛方式(长×宽×高=3.00 m×1.50 m×1.35 m)进行发酵，发酵物料初期含水量约为70%，堆肥过程持续约1个月(2021年8—9月)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集取样时间为第0天(初始期)(肥堆混匀后马上采样)、第4天(升温期)、第7天、第14天(高温期)、第21天(降温期)和第25天(腐熟期)，分别在堆体上层(距离底部105.00 cm)、中层(距离底部65.00 cm)、下层(距离底部30.00 cm)取样，每个横截面随机选4个点，将在同一横截面收集的样品均匀混合，每次取样后翻堆。样品按照采样时间(0～25 d)分为6个试验组，依次标记为A、B、C、D、E和F，堆体上、中和下层取样分别标记为1、2和3，即第0天上层采集的样品记为A1，中层采集的样品记为A2，下层采集的样品记为A3，依次类推，直至发酵第25天取上层样品记为F1，中层样品记为F2，下层样品记为F3，共计18份样品(表1)。为比对效果，同期采集该规模化养鸡场加入有机物料腐熟剂并完成发酵(>30 d)的成品肥料样品(记为G)和有机物料腐熟剂[主要成分为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和放线菌(Actinomycetes)]样品(记为H)。将采集的8个分组(A～H)共计20份样品立即置于液氮罐中储存，用于细菌群落分析。

表1 鸡粪样品标记信息

1.2.2 高通量测序将1.1中采集的20份堆肥样品送至北京擎科生物科技有限公司进行基于Illumina NovaSeq平台的细菌16S rDNA V3+V4可变区高通量测序。

1.2.3 数据处理测序完成后采用Trimmomatic version 0.33对原始数据进行质量过滤[17]，然后以 Cutadapt version 1.9.1进行引物序列识别与去除[18]，再以FLASH version 1.2.11对双端Reads进行拼接[19]，以UCHIME version 8.1去除嵌合体[20]，最终得到高质量的序列用于后续分析。采用USEARCH version 10.0在相似度97%水平对序列进行聚类[21]。以Silva为参考数据库使用朴素贝叶斯分类器对特征序列进行分类学注释[22]，得到每个特征对应的物种分类信息，进而在门、纲、目、科、属、种(phylum，class，order，family，genus，species)水平统计各样品的群落组成，利用QIIME生成不同分类水平的物种丰度表[23]，再利用R语言工具绘制样品在各分类学水平下的群落结构图。对不同组样品的Alpha多样性指数进行评估[24]，包括度量细菌群落丰度的Chao1指数和Ace指数及度量细菌群落多样性的Shannon指数等。最后以LEfSe(LDA effect size)分析堆肥过程中不同发酵时间的组间物种差异，默认设置显著差异的Logarithmic LDA score为4.0[25]。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel 2019进行整理，以SPSSAU平台中独立样本T检验对不同发酵时间样品的Ace指数进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 物种分类和相对丰度分析

将20份样品进行高通量测序，共获得1490 847条有效序列，其中H组样品测得的有效序列最多。对得到的有效序列数(Reads)在97%相似度水平下进行聚类，共得到18 869个分类操作单元(OTU)，其中F2样品(第25天中层)测得的OTUs最多，其次为F1样品(第25天上层)和G样品(表2)。8个分组(A～H)共有的OUTs有524个，其中6个试验组(A～F)共有的OUTs分别为535、571、550、604、569和685个。为了比较各样品中的物种多样性，将每个样品中测得的序列数标定在45 000条(20份样品中最少的序列数)。从OTUs稀释曲线(图1-A)可看出，F1样品(第25天上层)的稀释曲线最陡峭，物种丰富度最高，H样品(腐熟剂)的稀释曲线最平滑，物种丰富度最低；当测得的序列数>40 000时，各样品的OTUs稀释曲线已趋于平缓；各样品Shannon指数的稀释曲线与OTUs稀释曲线不同，当测得的序列数<10 000时已趋于平缓(图1-B)；各样品的文库覆盖率(Coverage)均超过99.50%(表2)，说明本次测序的深度足够深且数据量足够大，已基本覆盖样品中所有的物种信息，可代表本研究堆肥中细菌菌群分布的真实情况。

图1 鸡粪样品的OTUs稀释曲线和Shannon指数曲线

表2 不同鸡粪样品中的细菌丰度和多样性

对于在同一位置采集的样品，随着堆肥时间的延长，其Ace和Chao1指数多呈上升趋势，说明鸡粪堆肥中细菌菌群的丰富度逐渐提高。采用T检验对不同发酵时间样品的Ace指数进行比较，结果(图2)发现，F组(第25天采集)的细菌Ace指数显著高于A组(第0天采集)、B组(第4天采集)和C组(第7天采集)(P<0.05，下同)，高于D组(第14天采集)、E组(第21天采集)和H组(有机物料腐熟剂)，低于G组(成品肥料)，但差异不显著(P>0.05)，说明鸡粪堆肥能提高其细菌群落的丰富度，尤其是堆肥后期样品细菌群落的丰富度显著高于堆肥前期，而通过比较试验组(A～F)与G组的细菌Ace指数差异发现，加入腐熟剂也能提高堆肥中细菌的丰富度。比较Shannon指数发现，细菌群落多样性最高的3份样品为B1(第4天上层)、E3(第21天下层)和G，最低的3份样品为H、F3(第25天下层)和E1(第21天上层)；A1～F1样品(堆肥上层)细菌群落的相对丰度随着堆肥时间的延长呈先上升再下降最后又略微上升的变化趋势，B2～F2样品(中层)也表现出相似的变化趋势，但A3～F3样品(下层)的表现与A1～F1样品相反，其细菌群落的相对丰度呈先下降后上升最后急剧下降的变化趋势，说明不同发酵时期堆肥中的细菌群落多样性均处于动态变化中；通过对比G和H样品的Shannon指数得出，腐熟剂(H)作为微生物制剂其多样性最低属于正常现象，而加入腐熟剂并完成发酵(>30 d)的成品肥料(G)表现出比同时期的F样品(第25天采集)更高的细菌群落多样性，说明腐熟剂能改变并提高堆肥中的细菌群落多样性。

*表示样品间差异显著(P<0.05)。

2.2 堆肥中细菌的门水平分类和属水平分类

本研究共检测到26门57纲133目245科530属细菌，但仅将物种相对丰度排在前10位的菌门(属)分开展示，而相对丰度较小的门(属)合并为 Others(图3)。

从门水平来看(图3-A)，各组样品的细菌均以厚壁菌门、变形菌门、盐厌氧菌门(Halanaerobiaeota)、拟杆菌门和放线菌门5个菌门为主。其中，厚壁菌门的相对丰度随着堆肥时间的延长呈先下降后上升变化趋势，变形菌门的相对丰度从第0天(A样品)的21.90%下降到第25天(F样品)时的8.46%；与变形菌门的相对丰度变化趋势相反，盐厌氧菌门的相对丰度呈不断上升趋势(由A样品的0.02%上升至F样品的21.84%)；拟杆菌门和放线菌门的相对丰度均较稳定，未观察到明显的变化趋势。在堆肥试验组(A～F)中，厚壁菌门在堆肥每个发酵阶段的相对丰度均最高，其中在第7天(C组)中细菌的相对丰度最高(68.76%)，其次是在第0天(A组，67.31%)和第4天(B组，62.74%)，该菌门的相对丰度随着堆肥时间的延长逐渐下降，但在第21天(E组)后出现微小回升(54.53%，F组)。而在加入腐熟剂并完成发酵(>30 d)的成品肥料(G组)和腐熟剂(H组)中，厚壁菌门的相对丰度在各发酵阶段均最高，尤其以腐熟剂(H组)中的相对丰度(83.79%)更高，说明厚壁菌门在堆肥的各个发酵阶段均为优势菌群；变形菌门在第0天(A组)中的相对丰度最高(21.90%)，其次是在第4天(B组，15.29%)和第14天(D组，13.96%)，至堆肥的第25天后降至8.47%，说明该菌门为堆肥初期的优势菌群；盐厌氧菌门在第0天(A组)和腐熟剂(H组)中相对丰度仅为0.02%和0.05%，逐渐升高到第21天(E组)和第25天(F组)中的21.74%和21.84%，成为堆肥后期占比仅次于厚壁菌门的优势菌群；厌氧菌门中的细菌均为厌氧菌，且在G组仅观测到极低的相对丰度，推测原因可能是试验肥堆通风不佳和氧气含量不足所致。

从属水平来看(图3-B)，各样品中的优势细菌变化明显，主要集中在乳杆菌属、盐胞菌属(Halocella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)和埃希氏-志贺菌属(Escherichia-shigella)；乳杆菌属为堆肥起始阶段的优势菌属，从第0天(A组)时相对丰度最高(33.43%)逐渐下降到第25天(F组)时的1.17%；与乳杆菌属相反，盐胞菌属和芽孢杆菌属分别从第0天(A组)时极低的相对丰度(0.02%和0.08%)逐步上升到第25天(F组)时的21.84%和17.20%，但在G组中，仅观测到较低丰度的盐胞菌属(4.04%)，说明添加腐熟剂确实能改变堆肥细菌群落的相对丰度。此外，有2种潜在致病菌属(肠球菌属和埃希氏-志贺菌属)的相对丰度均从发酵开始时(A组)的12.43%和9.62%逐渐下降到发酵结束时(F组)的0.25%和0.65%，说明堆肥发酵确实能有效降低鸡粪中潜在致病菌的相对丰度。

图3 鸡粪堆肥样品在门(A)和属(B)分类水平上的细菌种类和相对丰度比较

2.3 不同分组间的LEfSe分析结果

对各样品进行LEfSe分析(P<0.05，LDA>4.0)，结果(图4)显示，从门水平到属水平，共有75个物种组间存在显著差异，包括2门5纲11目16科17属24种，其中第0天(A组)存在组间显著差异的物种最多，有19个，第4天(B组)和第14天(D组)存在组间显著差异的物种最少，均为2个；从门水平(图4-A)看，盐厌氧菌门在第25天(F组)中的相对丰度显著高于其他组，软壁菌门(Tenericutes)在第7天(C组)中的相对丰度显著高于其他组；在属水平(图4-B)上，堆肥起始阶段第0天(A组)共有4个菌属的相对丰度显著高于其他组，分别为乳杆菌属、肠球菌属、韦荣氏球菌属(Veillonella)和库特氏菌属(Kurthia)，其中肠球菌属、韦荣氏球菌属和库特氏菌属均是潜在的致病菌属，可见，鸡粪发酵前期堆肥中所含潜在致病菌属的相对丰度显著高于发酵后期，说明堆肥确实能降低相关致病菌的相对丰度。而在堆肥后期的第25天(F组)有3个菌属的相对丰度显著高于其他组，包括盐胞菌属等。

图4 不同鸡粪样品组中差异物种的进化分支图(A)和LDA分布情况(B)比较

3 讨论

本研究采用Illumina NovaSeq高通量测序技术对堆肥处理鸡粪中的细菌群落进行测序分析，共获得1490 847条有效序列，其中作为有机质腐熟剂的H样品测得有效序列最多，其物种多样性最低且以芽孢杆菌属为主要构成，与有机物料腐熟剂产品的主要成分要求相符，说明测序结果可靠，能提供可供分析的有效数据；OTUs稀释曲线和Shannon指数稀释曲线在序列数达到一定量后均趋于平缓，且各样品的文库覆盖率均超过99.50%，说明测序的广度和深度已基本覆盖样品中所有的物种信息，能满足开展研究的需求。

Alpha多样性是指某个特定区域的物种丰度或多样性，Ace和Chao1指数越大说明物种总数越多，而Shannon指数越大说明物种多样性越高。本研究发现，鸡粪堆肥不同分层的细菌Alpha多样性各不相同，且不同发酵时期堆肥中的细菌群落多样性一直处于动态变化中，将在同一位置采集的样品放在一起比较可发现堆肥上层样品(A1～F1)中细菌群落的相对丰度随着堆肥时间的延长呈先上升再下降最后又略微上升的变化趋势，中层样品(B2～F2)也表现出相似的规律，但下层样品(A3～F3)细菌群落的相对丰度呈先下降后上升最后急剧下降的变化趋势，与堆肥上层表现相反，推测是各部分样品含氧量不同而引起，与苏鹏伟等[15]、Hu等[26]的研究结果略有不同，可能与本研究选择将上、中和下层样品分开测序有关。

本研究中，鸡粪堆肥不同发酵时期的细菌群落构成存在明显差异，表明在堆肥各发酵时期均有适合的细菌在堆肥中发挥不同功能，与邓雯文等[12]、岳寿松等[16]、黄雅楠等[27]的研究结果相似；从门水平来看，厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门是堆肥中占比最多的细菌，其中厚壁菌门在堆肥的每个发酵阶段均为主要类群(占比均超过50.00%)，这主要得益于其对恶劣环境较强的抵抗能力，该菌门主要来源于动物的排泄物，其主要功能为分解碳水化合物，表明其在堆肥过程中一直有碳水化合物降解和转化伴随[26]；变形菌门和拟杆菌门属于嗜中温并在有机质降解中发挥重大作用的细菌，这2个菌门在堆肥高温期的相对丰度有所降低，之后在降温期有所升高，与苏鹏伟等[15]研究得出的结果相符。本研究还发现，盐厌氧菌门的相对丰度随着堆肥时间的延长不断增加，其最高占比可达21.84%，该菌门属于厌氧菌[28]，推测与与广西地区8—9月湿度较高、肥堆不易完全搅拌而造成含氧量不足有关。从属水平来看，乳杆菌属作为堆肥初期的优势菌属，随着堆肥的时间的延长其优势地位逐渐下降，与邓雯文等[12]、黄雅楠等[27]的研究结果相似；类似盐胞菌属和芽孢杆菌属属于耐热、耐盐菌属，其优势地位会随着堆肥时间的延长不断上升，逐渐成为肥堆中的优势菌属，而肠球菌属和埃希氏-志贺菌属是来源于动物的潜在致病菌属，其优势地位下降至极低水平。说明堆肥发酵确实能有效降低鸡粪中的潜在致病菌含量，但未能完全清除。

本研究结果表明，A组鸡粪发酵开始时其肠球菌属、韦荣氏球菌属和库特氏菌属等3个潜在致病菌属的相对丰度均显著高于其他组，说明堆肥发酵能有效降低鸡粪中的潜在致病菌的相对丰度。韦荣氏球菌属是分布于人和动物的口腔、咽部、呼吸道、消化道中的常在菌群，很少在堆肥发酵类的研究中被提及，但有研究报道表明其在一些严重感染或混合感染中发挥不可忽视的作用[29-30]。与韦荣氏球菌属相似，库特氏菌属也极少在相关研究中被发现，该菌属可用于治理环境污染[如降解多环芳烃(PAH)和抗生素]，但在我国也有该菌导致奶牛发生乳腺炎的报道[31]。畜禽粪便不仅会污染生态环境，其本身带有的一些人畜共患菌属也给公共卫生防控带来较大的风险。因此，开展鸡粪堆肥相关研究，探索其中的风险因子并提高堆肥发酵效率显得极为重要。