不同亚种间水稻糙米镉含量及微量元素的差异分析

于江辉，翁绿水，宋嘉俊, 2，刘腾飞，蒋显斌

(1.中国科学院亚热带农业生态研究所/亚热带农业生态过程重点实验室，长沙 410125；2.湖南农业大学农学院，长沙 410128；3.广西农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传育种重点实验室，南宁 530007)

【研究意义】水稻(OryzasativaL.)是世界上重要的粮食作物，全球近半数人口以稻米为主食，我国以大米为主食的人口在60%以上，且种植区域非常广泛。但由于工业“三废”排放及污水灌溉，化肥和农药的不合理使用等，导致土壤中重金属镉(Cd)含量急剧增加，在一定程度上影响水稻的质量安全[1-2]。为避免水稻中Cd积累过量，科学家提出并研究了一些降低水稻籽粒Cd积累的技术措施，主要概括为利用化学或生物学方法阻碍稻田中的Cd通过根系进入植物体内，或适当的农艺措施与耕作制度相结合进而减少Cd在水稻植株内的积累，有关研究表明以上方法虽有修复效果，但存在工程量大、成本高、易二次污染、修复周期长及效果缓慢等局限性[6]。因此，培育Cd低积累水稻品种被认为是最经济有效的调控措施[7-8]，对人体健康、食品安全、粮食稳产和环境保护等具有重要意义。此外，人体正常生理代谢需要约49种以上微量元素，任何元素的缺乏都可能不利于人体健康，其中微量元素Fe可防止贫血症，微量元素Zn可提高免疫力。研究表明全世界有30%以上的人群由于缺Fe或Zn而造成了“隐形饥饿”，同时经受着因微量元素缺乏导致的各种疾病的困扰[9-10]。为此，降低主粮作物的Cd含量和提高微量元素Fe、Zn含量具有重要的意义。【前人研究进展】近年来，就耐镉水稻种质资源的筛选及耐Cd品种的培育，科研人员进行了大量研究，并指出籽粒Cd含量在不同的亚种间、品种间有很大的差异[11-17]。Liu等[11]研究认为，籼稻和籼型杂交稻的糙米Cd含量显著高于粳稻和粳型杂交稻。曾翔等[12]以盆栽的方式对130份水稻品系的糙米Cd含量研究表明，特种稻>常规早稻>三系晚稻>两系晚稻>常规晚稻>常规粳稻>爪哇稻。黄春艳等[13]在高Cd试验田中鉴定603份水稻品系的糙米Cd含量，发现常规籼稻>常规粳稻，两系杂交稻>三系杂交稻，杂交晚稻>杂交中稻>杂交早稻。Sun等[14]通过对617份水稻品种糙米Cd含量进行分析，研究也认为籼稻糙米Cd含量显著高于粳稻，籼型杂交稻的糙米Cd含量总体不高于籼型常规稻。研究表明Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ni2+以辅因子的形式参与植物的光合作用、呼吸作用及氧化还原作用的相关蛋白质或酶的构建中，这些离子的功能涉及植物生理的众多方面[18-19]。而Cd是一种非必须有毒重金属元素，水稻植株或籽粒吸收和转运Cd需借助必需微量金属元素的离子通道，特别是由于Zn2+、Mn2+、Fe2+等二价阳离子与Cd2+具有相同的核外电子构型，而且这些金属转运蛋白与对应金属离子结合特异性较低。因此，Cd2+能通过占用Zn2+、Fe2+、Mn2+等植物生长必需元素的离子通道进入植物体内，从而导致植物体Cd含量的升高[20-21]。研究指出Zn2+和Cd2+同时存在拮抗和协同吸收作用机制，主要与土壤中对应离子的形态及含量有关[22-23]。张标金等[24]进一步研究指出，Mn促进Cd在水稻地上部分积累，且Cd、Mn互作与离子浓度及不同的水稻品系有关。而Sebastina等[25]报道，增加Fe、Mn含量可以降低水稻根系Cd积累量，表明Fe、Mn与Cd的吸收和积累存在拮抗作用。李娇等[26]利用水培试验也表明，增加Zn的供应导致水稻根系Cd含量显著降低，而茎Cd含量及转运系数大幅度显著提高。【本研究切入点】国内外学者对水稻耐Cd特性研究主要集中在不同水稻品种的差异上，或不同亚种间、杂交稻间稻米Cd含量的差异分析上，以及不同微量元素和Cd的吸收协同或拮抗作用的研究。但就通过不同亚种间杂交创制的水稻品系(如粳型、籼型、爪型、籼粳型、籼爪型)Cd积累差异比较、Cd与微量元素之间、微量元素相互之间关系的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究以粳型、籼型、爪型、籼粳型、籼爪型共77份耐Cd水稻品系为材料，在Cd重度污染区全生育期种植，成熟期测定不同类型供试品系糙米Cd、Zn、Mn、Cu和Fe元素含量，旨在分析不同类型亚种、亚种间杂交改造耐镉品系对Cd的累积特性，进一步分析5种类型水稻Cd含量和微量元素的关系及微量元素间的差异等，为高Fe、Zn且低Cd水稻品系的选育提供参考及种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品系为中国科学院亚热带农业生态研究所水稻分子生态育种课题组通过杂交、回交、复交等常规育种方法选育的高世代稳定籼型品系24份、籼粳型品系7份、籼爪型品系13份；引进籼型品系1份‘浙农986’，引进粳型品系8份，引进爪型品系24份。上述77份品系为2015—2019年以低Cd邻近品系‘湘晚籼12号’为对照筛选出的相对耐镉水稻品种/品系(表1)。

表1 不同耐镉品系的糙米镉含量

1.2 试验方法

供试品系于2020年种植在中国科学院亚热带农业生态研究所北山试验站(107°30′E，31°47′N)，所有品系5月30日播种，秧龄25 d移栽，每品系种植2行，每行10兜，单本移栽，株行距分别为17和20 cm。采用常规栽培方法进行田间管理。

试验前取试验区域距表层土20 cm的样品采用王水消化-ICP检测法进行土壤全Cd含量鉴定，采用二乙基三胺五乙酸(DPTA)萃取-ICP检测法进行土壤有效Cd鉴定。经检测土壤全Cd含量0.97 mg/kg，是土壤Cd含量最大允许值(0.3 mg/kg)的3.23倍[27]，土壤有效Cd含量0.58 mg/kg，为重度镉污染区。其他理化指标：pH 5.3，有机质35.5 g/kg，阳离子交换量7.32 cmol/kg，氮含量1.55 g/kg，磷含量0.72 g/kg，钾含量13.7 g/kg。

供试耐Cd品系成熟后，每品种/品系随机取8～10个单株主穗混合收种，晒干、脱粒、去颖壳，之后60 ℃将糙米烘干、磨样，每品系用电子天平称2 g样本，用硝酸-高氯酸(v∶v= 5∶1)的混合酸进行消化。具体操作为：消化起始温度设置为80 ℃，每稳定30 min后依次升温至120、160、220 ℃。在此过程中样品由红棕色逐渐转化为无色透明态即为消化完全，继续升温至260 ℃待三角瓶内样品逐步呈“烟雾态”后，打开弯柄漏斗赶酸，当三角瓶中液体酸基本蒸发并析出白色或淡黄色晶体为止。随后用1%的稀硝酸溶液溶解析出的晶体，且转移至比色管中定容至10 mL，过滤后将待测样品由电感耦合等离子体发射光谱仪(Inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICPOES，Agilent technologies 700 Series，USA)检测糙米重金属元素Cd和微量元素Zn、Mn、Cu、Fe含量，取样和测量重复3次。

1.3 数据分析

不同类型耐镉品系糙米的Cd、Zn、Mn、Cu、Fe数据利用Microsoft Excel 2019进行常规统计；采用DPS 15.10软件对不同试验品系Cd和微量元素含量均值和标准差进行分析，随后计算变异系数，变异系数(CV/%)=标准差/平均值×100%，同时，对不同类型水稻品系金属元素含量进行多重比较和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同亚种、亚种间改良系耐镉品系糙米Cd含量的差异分析

2.1.1 不同亚种、亚种间改良系Cd含量的分布 2015—2019年，以‘湘晚籼12号’为低Cd对照，将课题组粳型品系56份、籼型品系626份、爪型品系148份、籼粳型品系46份、籼爪型品系334份、粳爪型品系13份在重度Cd污染区进行耐镉品系筛选，经过5年时间筛选得到耐镉粳型品系8份，占参试粳型品系的14.28%；籼型耐镉品系25份，占籼型品系的3.99%；爪型耐镉品系24份，占爪型品系的1.62%；籼粳型耐镉品系7份，占籼粳型品系的15.22%；籼爪型耐镉品系13份，占籼爪型品系的3.38%，而粳爪型没有筛选到耐镉品系。因此，籼粳型和粳型耐镉品系筛选比例较高，粳爪型耐Cd品系筛选比例最低，其次为爪型品系。同时将筛选到的77份耐镉品系于2020年进行糙米Cd含量分析。由图1可知，所有品系的糙米Cd含量在0.35～0.87 mg/kg(对照‘湘晚籼12号’为0.8803 mg/kg)，平均Cd含量为0.7245 mg/kg，较对照降低17.7%。根据糙米Cd含量将所有品系分为6个区段，随着Cd含量范围的提高，对应的水稻品系数量也逐渐增多，所占比例依次为1.3%、6.5%、11.7%、19.5%、27.3%、33.7.%。当0.3

图1 不同类型耐镉品系糙米Cd积累的分布

2.1.2 不同亚种、亚种间改良系Cd含量的分析 前人对不同亚种间水稻进行Cd胁迫研究分析认为糙米Cd含量为籼稻>粳稻>爪哇稻[11-12, 14]，据此推测不同亚种间杂交改良后代糙米Cd含量应为籼粳交>籼爪交。本研究对5种亚种、亚种间改良系耐镉水稻品系平均糙米Cd含量分析结果为籼粳型>籼爪型>籼型>粳型>爪型(表2)，同前人的研究及推测相印证。同一类型的耐镉品系糙米平均Cd含量间亦有差异，其中变异系数最大的为籼型，其次为爪型，而粳型和籼爪型差异不明显，变异系数不大，介于11.59%～20.03%；籼型、爪型、籼爪型Cd含量极大值较接近，而镉含量极大值最小的为籼粳型品系，最大的为籼型品系；Cd含量极小值间存在明显差异，最低的为籼型品系，最高的为籼粳型品系。因此，虽然本研究表明糙米平均Cd含量籼粳型最高、爪型最低，但并不代表单个Cd含量最高品系为籼粳型，或单个Cd含量最低品系为爪型，即同一亚种或亚种间改良系不同品系间有较大差异。

表2 不同类型水稻糙米Cd含量的比较

2.1.3 不同亚种、亚种间改良系和生育期的关系 水稻的生育期越长，其产量会相对较高，同时吸收并积累到植株自身的Cd会相对较多，因此人们凭直觉认为，稻米Cd积累与生育期及产量成正比[28]。本研究对77份耐镉品系的糙米Cd含量和生育期相关分析表明，稻米Cd积累与生育期间无显著相关性(R=0.149，P=0.2476)，而就5种类型耐镉水稻单独分析时，粳型、爪型糙米Cd含量与生育期间为差异极显著正相关(P<0.01，下同)，表明粳型、爪型品系生育期延长会增加糙米Cd的积累，因此，粳型、爪型耐镉品系选育时应选取生育期短的材料；而籼型、籼粳型、籼爪型糙米Cd含量与生育期间无差异显著相关性(P>0.05，下同)，表明这3种类型品系糙米Cd含量不受生育期的影响。因此，其耐镉品系的选育不用考虑生育期。而且本研究表明不同类型的耐镉品系生育期之间有较大差异，其中爪型、籼爪型品系的生育期之间差异显著(P<0.05，下同)，而其他类型品系间生育期差异不显著。爪型品系的平均生育期最长，但变异系数较小，表明生育期较集中，熟期类型较一致；籼爪型品系的生育期平均最短，但变异系数最大，表明本研究的籼爪型品系熟期类型不同；粳型、籼粳型品系生育期较集中、变异系数小、熟期较一致；籼型品系生育期变异系数较大，表明熟期类型不同(表3)。

表3 不同类型耐镉品系的生育期差异及生育期与糙米镉含量的相关性

2.2 不同亚种、亚种改良系微量元素的分析

2.2.1 不同亚种、亚种改良系Cd含量和微量元素的关系 由表4可知，粳型水稻糙米Cd含量与Zn、Cu分别为差异极显著正相关，表明粳型低Cd品系糙米Zn、Cu含量较低，而与Mn、Fe含量无差异显著相关性；籼型水稻糙米Cd含量与Mn、Cu、Fe均为差异显著正相关，与Zn含量为差异显著负相关，说明籼型低Cd品系Mn、Cu、Fe含量较低，Zn含量较高；爪型水稻糙米Cd含量与Zn、Cu分别为差异极显著、显著正相关，与Mn、Fe含量无差异显著相关性，表明爪型耐Cd品系糙米Cd、Zn、Cu含量协同降低；籼粳型水稻糙米Cd与Mn含量为差异显著正相关，与其他元素间无显著差异，表明籼粳型耐Cd品系Mn较低；籼爪型水稻糙米Cd与Zn、Mn、Cu、Fe 4种主要微量元素含量无差异显著，表明籼爪型耐镉品系糙米4种微量元素含量与Cd积累无关。综上所述，高营养(高Fe、Zn)且低Cd水稻品系以籼爪型最理想，因为籼爪型耐Cd品系糙米中4种主要微量元素含量不受Cd积累量的影响。

2.2.2 不同亚种、亚种改良系微量元素的差异 进一步研究表明，Zn、Mn、Cu、Fe 4种微量元素含量在不同亚种、亚种改良系间的耐Cd水稻中有较大差异。由图2可知，籼型水稻糙米Zn含量极显著低于其余4种类型，且其他4种类型品系间差异不显著，但爪型Zn含量最高，粳型次之，籼型Zn含量最低，Zn含量最高的爪型杂交创制而成的籼爪型Zn含量介于籼型和爪型之间，籼粳型水稻Zn含量介于籼型和粳型之间；粳型Mn含量极显著高于籼型、籼粳型、籼爪型，高于爪型，但差异不显著，籼粳型Mn含量最低，而且籼粳型、籼爪型Mn含量均低于其双亲类型(粳型、籼型、爪型)；籼型糙米Cu含量极显著高于其他4种类型，其他4种类型水稻Cu含量接近且无显著相关性，以Cu含量较高的籼型杂交创制而成的籼粳型、籼爪型水稻糙米Cu含量并未大幅度提高，而是与粳型、爪型较接近；糙米Fe含量最高的为爪型，且与籼粳型、籼爪型差异极显著，与粳型、籼型差异显著，籼粳型、籼爪型Fe含量均低于双亲类型。综上所述，与稻米高营养相关的微量元素Fe、Zn在5种耐镉类型品系中，以粳型、爪型品系较高，籼粳型、籼爪型次之，而籼型品系的Zn含量极低，营养价值不高。

同一图中不同大、小写字母分别表示在0.01和0.05的显著性水平。

2.2.3 不同亚种、亚种改良系微量元素间的相关性分析 由表5可知，粳型耐镉品系Cu与Zn之间R为差异极显著正相关(P<0.01)，相关系数较高(r=0.8826)，表明粳型耐镉品系Zn和Cu的吸收具有协同作用，而其他元素间无显著相关性；籼型耐镉品系Zn与Cu、Fe之间为差异极显著负相关，Cu、Mn、Fe之间互为差异显著正相关，表明Zn与Cu、Fe的吸收为拮抗作用，而Cu、Fe、Mn的吸收互为协同作用；爪型耐镉品系Fe和Mn之间为差异显著正相关，即为协同作用，其他元素间无差异显著相关性；籼粳型耐镉品系除Cu、Fe间无显著相关性外，Zn、Mn、Cu、Fe间互为差异极显著正相关，均为协同作用，微量元素间含量较易调控；籼爪型耐镉品系Zn、Mn、Cu、Fe之间为差异极显著正相关，4种元素间互为协同作用，其中Fe与Zn之间相关系数最高，因此籼爪型品系低Cd高Fe、Zn型营养水稻品系最易培育。以上研究表明，不同类型耐镉品系4种微量元素间的协同或拮抗作用不同，与不同亚种或亚种间互作的遗传基础关系密切。

表5 不同类型耐镉品系Zn、Mn、Cu、Fe之间的相关性分析

3 讨 论

Sun等[14]利用全生育期干湿交替的方法鉴定出617份水稻品种稻米Cd积累与生育期的关系，结果表明稻米Cd积累与生育期相关系数较低。研究发现，水稻低Cd基因与生育期基因存在连锁累赘现象，稻米Cd积累和生育期都是有多基因控制的数量性状，个别基因的连锁并不代表二者的性状一定存在相关性，而且生育期相同的品种，稻米Cd积累量也有较大差别[28]。而Duan等[29]采用常规的水分管理模式对471份水稻品种的稻米Cd积累与生育期的关系进行鉴定，结果表明稻米Cd积累量与生育期为显著正相关。本研究通过对粳型、籼型、爪型、籼粳型、籼爪型5种类型的常规稻籽粒Cd含量和生育期的分析，结果表明在77份耐镉品系不分类型的情况下，糙米Cd含量和生育期间无显著相关性，印证前人的研究结果[14, 28]。而对不同类型的耐镉品系进行分析，粳型、爪型品系糙米Cd含量和生育期间为差异极显著正相关，籼型、籼粳型、籼爪型品系糙米Cd含量和生育期间无差异显著相关性。可见，生育期对籼型或具有籼型遗传背景的材料糙米Cd含量影响较小。由于水稻不同亚种间基因型的差异，导致Cd积累在不同亚种间有较大的差异，糙米Cd含量为籼稻>粳稻>爪哇稻[11-12, 14]，而且本研究对不同类型的耐镉品系生育期的分析表明粳稻<籼稻<爪哇稻。因此，由于不同亚种间品系Cd含量及生育期的差异，导致5种类型品系籽粒Cd含量和生育期呈现出不同的相关关系。

Tan等[30]对575份水稻品系的11种矿质元素研究发现糙米Cd含量与Zn、Mn、Cu、Fe含量呈显著负相关。Pinto等[31]研究表明微量元素Mn和Zn主要通过拮抗作用来抑制Cd从营养器官向稻米的转移。这些研究表明Cd和二价金属离子间存在竞争关系和拮抗作用[20-21]。而Sun等[14]研究认为，镉污染稻田籽粒Cd含量与Cu、Fe、Mg、Mn、Ni、Pb、Zn等金属元素含量无显著相关性。可见，由于不同的试验条件和不同的供试水稻材料，对Cd和二价金属离子间的关系得出不同的试验结果。而且前人对试验材料没有精准分型，主要集中在不同品种Cd和金属元素间关系的分析。本研究表明不同类型品系间由于基因型的不同对Cd和微量元素的吸收有较大差异，其中粳型耐镉品系糙米Cd含量与Zn、Cu为差异极显著正相关，籼型耐镉品系糙米Cd含量与Mn、Cu、Fe为差异显著正相关，与Zn为差异显著负相关，爪型耐镉品系糙米Cd含量与Zn、Cu为差异显著正相关，籼粳型糙米Cd含量与Mn为差异显著正相关，而对应不同类型耐镉品系其他测量元素间无显著相关性，特别是籼爪型耐镉品系糙米Cd含量与Zn、Mn、Cu、Fe间均无显著相关性。因此，本研究揭示了不同类型耐镉品系糙米Cd含量与多种微量元素间的不完全显著相关关系，同时进一步说明5类型低镉品系的培育对部分微量元素的吸收有影响，由于籼爪型品系糙米Cd含量与4种微量元素的含量无显著相关性，研究认为籼爪型低Cd高营养(高Zn、Fe)品系的选育意义较大。

近年来，利用分子生物学技术培育低Cd水稻品种取得较大的研究进展，截止目前，至少已经克隆了34个调控水稻Cd吸收、运输和积累的相关基因[3, 23]。其中一些基因不仅可以降低水稻籽粒Cd含量，而且对营养元素的吸收无影响。OsLCT2基因编码的水稻低亲和阳离子转运蛋白OsLCT1是水稻韧皮部中Cd转运的主要转运子，OsLCTRNAi干扰导致籽粒Cd含量大约为对照组的50%，且籽粒中矿物质营养成分以及植株生长和产量不受影响[32]；OsHMA3基因在水稻根中高度表达，位于根部液泡膜上，能与流入胞质溶胶中的Cd螯合，限制其从根部向地上部位转移从而降低植株中Cd积累，过表达OsHMA3可以显著降低籽粒Cd含量且不影响其他微量元素[33]。因此，以本研究培育的相对低Cd高营养(高Zn、Fe)籼爪型品系为受体，以含有低镉基因OsLCT2、OsHMA3等材料为供体，通过杂交、多代回交和MAS分子标记跟踪培育新的水稻品系，可进一步降低糙米镉和协调微量元素的含量。此外，由于许多调节Cd吸收和积累的转运蛋白普遍具有广泛的底物范围，除Cd元素外，还能够运输水稻生长发育所必需的微量元素(如Mn、Fe和Zn等)[34]。因此，有些基因对微量元素的吸收也有影响。如OsIRT1和OsIRT2基因属于ZIP蛋白家族，对Cd2+和Fe2+有转运作用[35]；ZIP家族中OsZIP5和OsZIP9基因对Zn和Cd有向内转运的功能[36]；水稻的7号染色体OsNRAMP5基因主要负责必需元素Mn的转运，还参与水稻中Cd、Fe元素的运输，OsNRAMP5基因的敲除或表达量的减少会显著降低水稻对Cd、Mn等的吸收，导致在缺Mn环境下会影响植株的生长，进而影响产量[37-40]。如果以本研究的籼爪型品系为受体，OsIRT1、OsIRT2、OsZIP5、OsZIP9、OsNRAMP5等低Cd基因为供体，进行杂交和多代回交及利用MAS跟踪目的基因，使新选育的品系遗传背景接近受体籼爪品系，能否进一步创制有效降低糙米Cd含量且不影响或对微量元素吸收影响较小的水稻新品系有待深入研究。

大量的研究表明水稻微量元素含量之间呈现不同的相关关系。Wang等[40]研究报道水稻籽粒中Cu、Zn和Mn之间均为差异显著正相关。Ren等[41]研究表明水稻籽粒中Fe与Ca、As，Zn与Mg、Cu以及Mg与Cu之间均呈现正相关。李军等[42]在土壤Cd含量为5 mg/kg的高度污染区种植32份粳稻品系，成熟后通过检测稻米微量元素含量，研究表明Cu、Fe、Mn、Zn、Si之间为差异极显著正相关。而国内外学者关于耐镉水稻品系微量元素之间的关系研究较少，特别是不同亚种间及亚种间杂交选育的耐镉水稻品系微量元素的关系研究鲜见报道。本研究表明，耐镉水稻粳型、籼型、爪型、籼粳型、籼爪型籽粒微量元素之间的关系不同。粳型品系Cu与Zn为差异极显著正相关，籼型品系Zn与Cu、Fe间均为差异极显著负相关，同时Fe与Mn、Cu之间均为差异显著正相关，爪型品系Fe与Mn为差异显著正相关，籼粳型品系Zn、Mn、Fe之间以及Zn、Mn、Cu之间为差异显著正相关，特别是籼爪型品系Zn、Mn、Cu、Fe之间为极显著正相关。而且籼爪型品系4种微量元素与Cd含量无显著相关性。因此，本研究认为籼爪型耐镉品系微量元素含量易于调控，提高4种微量元素的任何一种其余3种含量可能也会增加，进一步证实本研究提出的籼爪型低镉高营养品系材料的选育对Cd及微量元素的含量易于调控的观点。

4 结 论

本研究通过5种亚种及亚种间杂交改良系共77份耐镉水稻品系糙米Cd和Zn、Mn、Cu、Fe 4种微量元素含量的分析，表明籼爪型品系糙米Cd含量和生育期间无差异显著相关性，即生育期不会影响对Cd的吸收；籼爪型品系糙米Cd含量与4种微量元素的含量无显著相关性，即糙米镉含量的降低不会影响对微量元素的吸收，且Zn、Mn、Cu、Fe之间为差异极显著正相关、互为协同作用，提高任何一种微量元素其余3种含量也会增加。因此，籼爪型品系糙米Cd低积累、且Fe、Zn高营养型水稻品系具有较好的培育前景。