红三叶种子对纳米铁的响应研究

李羽超莫海凤王田祁兆奔刘权

(1.兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730000；2.平凉市农业科学院，甘肃 平凉 744000)

前言

近年来，纳米材料在农业上的应用越来越广泛[1]。许多研究表明施用纳米肥料能促进种子萌发、减少化肥施用、提高作物抗性、增加产量、改善品质[2-4]。纳米铁对植物生长的影响主要是通过提高光合速率和增强植物抗氧化能力两条途径[5]。Waqas等[6]发现，纳米铁能通过提高干旱胁迫的亚麻植物中光合色素水平，增强抵抗干旱胁迫的能力。纳米铁氧化物能通过提高玉米细胞中铁含量，增强植物抗氧化能力，显著促进生长，增加地上部可溶性蛋白含量[7]。有研究认为纳米铁作为种子引发剂，能提高柳枝稷种子活力并促进幼苗生长，是通过缩短吸涨后的滞后时间、活化发芽相关的酶活性、增加萌发代谢物的积累、修复种子损伤和渗透调节5个方面实现种子萌发的促进作用[8]。Rakesh等[9]证实了用50ppm纳米Fe3O4代替传统铁源，能显著提高水稻种子的发芽率、活力指数、含水量和干重。

红三叶(Trifolium pratense L)，是一种利用价值很高的牧草，其产量高，品质优良，在国内外分布广泛，是家畜的优良饲料。红三叶具有很高的药用价值，其提取物中的异黄酮具有防止乳腺癌，提高机体免疫功能，抑制前列腺增生，预防骨质疏松，缓解更年期综合症等作用[10,11]，而且是该植物种群竞争和环境适应的主要物质之一[12]。红三叶是建植混播草地的优良草种，但实践表明红三叶存在幼苗不易顺利出土[13]，苗期生长缓慢的问题[14]，需要采取一些措施来提高红三叶种子活力。

利用纳米铁作为种子引发剂，提高红三叶种子萌发效率和幼苗生长活力的相关研究尚未见报道。本研究所用的纳米铁材料为由Fe3O4包裹的铁单质，同时具有单质铁和氧化铁的特性。设置4个浓度的纳米铁(0mg·L-1、20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1)处理，观察对2个品种红三叶种子萌发和幼苗生长特性的影响，旨在探究纳米铁在红三叶种子萌发时期对其影响及作用机制，为牧草种植管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料：本试验所用400 mg·L-1纳米铁(粒径43.5nm)来自甘肃谷硕纳米农业科技有限责任公司。“海发”(HF)、“瑞德”(RD)红三叶种子购买于兰州种子市场。

1.2 种子发芽试验

先用清水清洗种子5min，用2%次氯酸钠溶液浸泡30min，再用蒸馏水清洗，待用。

用蒸馏水将400mg·L-1纳米铁溶液稀释至20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1，用吸管取20mg·L-1、50mg·L-1、100mg·L-1的纳米铁溶液5mL放入铺有2层滤纸、内径为9cm的一次性培养皿中，标记各处理。将红三叶种子摆放入培养皿，盖上培养皿盖子，置于25°C恒温培养箱中培养，光照条件为12h·d-1。每日向培养皿添加适量蒸馏水，保持滤纸湿润。以未添加纳米铁溶液的作为对照。每个处理重复3次，每个培养皿放置100粒红三叶种子。

将培养得到的植物幼苗全株于60℃下烘干，粉碎得到植物样品。取10mg植物样品，加入300μL40%乙醇溶液，在50℃下超声提取30min，得到待测液，进行异黄酮和多糖的测定[15]。

1.3 数据采集

1.3.1 种子发芽率和发芽势的测定

分别于红三叶种子培养第1天、第2天、第3天、第4天、第5天和第7天，统计种子发芽情况。利用第3天发芽情况计算发芽势，第7天计算发芽率。于第4天、第5天、第6天、第7天和第10天，分别从每个培养皿取5株长势良好的红三叶幼苗，测定芽高、根长和生物量。

种子发芽率(%)=发芽种子数/供试种子总数×100%

发芽指数的计算：

GI=Σ(Gt/Dt)

式中，Gt为发芽试验终期内每日发芽数；Dt为发芽日数；Σ为总和。

活力指数的计算：

VI=GI×S

式中，GI为发芽指数；S为幼苗重量，g。

1.3.2 幼苗异黄酮含量的测定

红三叶异黄酮含量的测定采用分光光度法。以芒柄花素为标准品，准确配制浓度为0.057mg·mL-1的标准溶液。分别准确移取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL、2mL、3mL于7个10mL容量瓶，用40%乙醇分别定容，摇匀后于275nm处测定吸光值，参比为空白试剂。取样品提取液按上述方法于275nm处测定吸光值，计算样品中的异黄酮含量。

1.3.3 幼苗多糖含量的测定

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸比色法[16,17]。用蒸馏水配制0.1mg·mL-1葡萄糖标准液，分别取0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL的0.1mg·mL-1葡萄糖标准液于10mL的试管中，分别加入0.5mL、0.4mL、0.3mL、0.2mL、0.1mL和0mL蒸馏水，再依次向各试管中加入0.5mL浓度为5%的苯酚溶液和2.5mL浓硫酸，摇匀，室温静置30min，测定每个样品于490nm处的吸光值。取0.1mL的样品溶液置于10mL试管，加入0.4mL蒸馏水，如上操作计算样品中的多糖含量。

1.4 数据分析

使用Excel 2016软件整理数据，SPSS Statistic 24.0进行数据统计分析和差异显著性检验，显著性水平为P<0.05。使用单因素(One-way ANOVA)和Duncan法进行方差比较和多重比较。

2 试验结果

本试验通过分析检测纳米铁对红三叶种子在不同天数发芽率的变化，以及幼苗芽高、根长、生物量和次生代谢物的影响，研究其对红三叶种子萌发的影响情况。

2.1 纳米铁对种子发芽的影响

为了充分了解纳米铁的作用效果，本文选用了发芽率具有显著性差异的2个红三叶品种进行，“海发”种子在不同处理下的发芽率均显著高于“瑞德”种子，约60%的“海发”种子在试验第1天就已萌发，而“瑞德”种子在第1天的发芽率仅有约30%，在第2天才能达到60%左右的发芽率。如图1所示，虽然纳米铁在第1天和第2天对2个品种的发芽率都有一定的促进作用，特别是高浓度处理，但整体而言，纳米铁对“瑞德”与“海发”种子的发芽率无显著影响。

注：a、b分别为“瑞德”和“海发”种子的发芽率；D1、D2、D3、D4、D5、D7表示天数；0、20、50、100表示不同浓度的纳米铁处理。

2.2 纳米铁对幼苗生长的影响

2.2.1 芽高

如图2所示，2个品种幼苗生长在第4天、第5天、第6天和第7天存在显著差异，未添加纳米铁处理中“瑞德”品种的芽高均显著低于“海发”。纳米铁处理后的“瑞德”在第4天芽高显著增加，和“海发”幼苗无显著性差异，但在随后的时间里与未添加处理无显著差异，“瑞德”芽高均小于“海发”。在第10天时，2个品种芽高已无显著性差异。

综合幼苗生长4～10d的情况来看，纳米铁对“瑞德”幼苗影响相对较大，特别是在第4天。而“海发”幼苗在施加20mg·L-1纳米铁的处理下芽高略高于其他处理。

注：小写字母表示与对照组在P<0.05水平差异显著；下同。

2.2.2 根长

如图3所示，在幼苗生长的4～10d中，各处理下“海发”幼苗的根长均极显著高于“瑞德”幼苗(P<0.01)。

与对照相比，不同浓度的纳米铁对“海发”幼苗的根长无显著性影响。对于“瑞德”幼苗，仅在幼苗生长第4天时，20mg·L-1处理根长显著高于对照。综合幼苗生长4～10d的情况来看，“瑞德”幼苗在100mg·L-1的纳米铁处理下根长略高于其他处理，“海发”幼苗在50mg·L-1的纳米铁处理下根长略高于其他处理。

2.2.3 生物量

纳米铁对幼苗生物量的影响如图4所示，幼苗生长第4天时纳米铁处理的“瑞德”幼苗生物量均显著高于对照组，但幼苗生长5～10d时，“瑞德”各处理之间无显著性差异。“海发”幼苗生长4～10d中，不同处理下幼苗生物量均无显著性差异。2种品种相比，相同处理下“海发”幼苗生物量显著高于“瑞德”。

从图3中观察可得，幼苗生长至第6天前，施加一定浓度的纳米铁的幼苗生物量略高于对照组，但在生长第7天后，施加纳米铁的处理生长速率放缓，对照组生物量略高于施铁处理。

图3 纳米铁对红三叶根长的影响

图4 纳米铁对红三叶生物量的影响

从表1可知，2种品种相比，“海发”的发芽指数和活力指数均显著高于“瑞德”，但同一品种不同处理之间种子的发芽指数无显著差异，说明纳米铁对红三叶种子发芽无显著性影响。“瑞德”的活力指数远低于“海发”，约为“海发”的1/2。纳米铁处理对红三叶种子活力具有一定影响，“瑞德”100mg·L-1处理显著高于对照，“海发”50mg·L-1处理显著高于对照。

2.3 纳米铁对幼苗代谢的影响

植物的次生代谢反映了植物适应生态环境的结果，是植物用于提高自身抗性、调节植物生长的一个重要方式[28]。因为幼苗量少，所有其多糖和异黄酮的测定无法进行重复性试验，但目前的数据结果仍能明确反映出纳米铁对幼苗生长阶段的影响。

2.3.1 多糖含量的变化

种子萌发后幼苗的生长会消耗种子中储存的营养物质，从图4中观察可得，不同处理下种子萌发后第5天、第6天均有多糖含量迅速提升的阶段。红三叶幼苗多糖含量在生长过程中呈现下降趋势，这可能与多糖作为种子中重要的能量存储物质有关。其中，“海发”的多糖含量大多高于“瑞德”，这与其幼苗生物量情况相符。“瑞德”100mg·L-1处理和“海发”50mg·L-1的多糖含量均表现为较低水平，而这2个处理的活力指数是在不同处理中最高。但值得注意的是，“海发”在第7天和第10天时，纳米铁处理明显增加了幼苗多糖含量。

“瑞德”幼苗对照组4～10d的多糖含量经历先减少后增加再减少的过程，代表了种子生长消耗糖类、脂质转化为糖类、糖类再消耗用于生长的过程。100mg·L-1纳米铁促进了“瑞德”幼苗的萌发和初期生长，但发育到6～10d后，“瑞德”幼苗的多糖含量显著低于其他处理，这可能是因为种子萌发和生长导致种子中储存的营养物质消耗较大，而50mg·L-1处理处理虽然在生长的7～10d也存在消耗较大的问题，但在7～10d多糖含量已经表现出明显的上升趋势。

表2 纳米铁对红三叶幼苗多糖含量的影响

2.3.2 异黄酮含量的变化

异黄酮是红三叶体内重要的抗逆物质，具有抗氧化等活性，幼苗阶段植株对外界培养条件响应敏感，因此波动较大。如表3所示，随着幼苗生长，红三叶体内的异黄酮含量总体呈上升趋势。纳米铁对2个品种异黄酮含量影响情况不同，对照的“瑞德”异黄酮含量保持在相对较高的水平上，而对于“海发”50mg·L-1处理下含量较高。20mg·L-1处理下，2个品种的异黄酮含量均处于较低水平。

2.3.3 相关性分析

从表4相关性分析结果发现，红三叶生长指标(芽高、根长、生物量)之间均为极显著相关，异黄酮对红三叶根长和生物量的发展具有显著的促进作用。虽然多糖与各项指标之间无显著相关性，但在生长过程随着芽高、根长和生物量的增加，多糖呈现出负增长，与其作为能量物质的特性相关。

表3 纳米铁对红三叶幼苗异黄酮含量的影响

表4 红三叶幼苗各指标间的相关性分析

3 讨论

种子活力是优质种子的基本特点，其不仅包括种子的发芽能力，还涉及到种子幼苗的成活率和生长力乃至作物产量[18]。本试验结果发现，纳米铁对红三叶种子发芽率无显著影响，但施加纳米铁能显著提高种子的活力指数。

幼苗生长也是种子活力的表现之一，纳米铁对2个品种红三叶的芽高、根长、生物量均无显著影响。施加50mg·L-1纳米铁的“海发”幼苗的芽高和根长均较对照组略高，而不同浓度纳米铁对“瑞德”幼苗的生长指标均无促进作用，不过第4天时，施加纳米铁的“瑞德”幼苗芽高均显著高于对照组，可能是因为纳米铁使得“瑞德”种子提前发芽。综合“瑞德”与“海发”幼苗的生长情况，施加纳米铁能够促进幼苗地上部分的生长，但对幼苗的根系发育无显著影响。这与Sundaria等[19]的研究结果一致，用一定浓度的纳米Fe2O3引发小麦可以显著增加小麦的株高。这可能是由于纳米铁易被植物吸收，促进了植物中叶绿素的合成，从而加快了地上部分的生长。

异黄酮作为红三叶的重要功能成分物质，与根长和生物量积累具有显著正相关，对于提高植物防御能力和种群竞争力都有重要意义。红三叶种子的多糖作为能量存储物质，而且最新研究结果表明，红三叶多糖还具有显著的抗氧化活性[15]，与异黄酮一起对幼苗生长提高防御和保护。纳米铁处理对红三叶中异黄酮和多糖含量未见显著影响。

本文结果不够显著，可能是因为浓度较低。但是对于纳米肥料而言，如果大量试用就不够经济，也无法体现纳米肥料绿色高效的特点。本研究结果表明，纳米铁肥对红三叶种子发芽和幼苗生长的促进作用不够显著。

4 结论

本文研究结果表明，纳米铁应用于红三叶种子种植过程中较为安全，不仅无显著性抑制作用，还有一定的促进效果。100mg·L-1以内的纳米铁处理对红三叶种子发芽率影响较小，对幼苗生长有一定促进作用，但不同品种影响效果相差较大。此外，红三叶异黄酮代谢与幼苗根长、生物量积累有着显著正相关，纳米铁对不同品种红三叶的影响效果也不同。本文结果将对红三叶种植过程中纳米肥料的精准施用提供理论指导。