红三叶个体水平异黄酮含量的差异及其形态特征和草产量比较研究

郝 宁，张晓明，穆赢通，李晓杰，奥 运，王俊杰

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

红三叶(TrifoliumpratenseL.)又名红车轴草[1]，为豆科三叶草属多年生草本植物，也是一种良好的多功能植物，具有营养价值高、适口性好、防止水土流失等特点。红三叶可为家畜提供多酚氧化酶，提高家畜乳和肉中的不饱和脂肪酸的水平[2]，改善肉公鸡的生长性能和肉质[3]，在北欧等地以饲用为栽培目标而广泛种植；同时，红三叶中还含有丰富的异黄酮类化合物，又称红三叶异黄酮(Red clover isoflavones,RCI)[4]，也被称为“天然的雌激素”，具有预防骨质疏松、提高机体免疫力、降低绝经后妇女潮热的频率等功能[5～9]。近年来国内外许多学者对红三叶异黄酮药用功效进行研究发现，红三叶的雌激素作用对帕金森患者的大脑有神经也保护作用[10]。此外，Ihsan等[11]研究表明红三叶异黄酮可以通过增加成骨细胞增殖、刺激基质活性来增强人体成骨作用。目前对于红三叶的研究主要聚焦于提高牧草营养品质、适口性及产量方面，对于红三叶药用活性成分对其农艺性状及产量的影响研究较少。

红三叶为异花授粉植株，具有自交不亲和的特性，经过长期栽培或自然杂交后会存在一定程度的遗传变异，产生不同的表型变异类型[12]，有些类型则表现出优异特性[13]。红三叶生长类型、叶面积和茎长等形态特征存在明显的差异[14]，可用于培育不同形态的品种，以适应不同用途[15]。张鹤山测定了来自国内外45份红三叶种质材料的形态特征，发现红三叶各表观性状在群体间和群体内具有不同程度的变异分化[16]。马一鸣[17]对大田中16种红三叶变异类型进行研究，结果表明，白花型红三叶产量高于其他花色红三叶，而高异黄酮含量红三叶大多具有粉花和紫花的特征。

本试验测定和林格尔县试验地300株红三叶异黄酮含量，采用K-means聚类分析法，将不同异黄酮含量红三叶聚类为4个类群(T1～T4)。对不同异黄酮含量的红三叶群体进行形态特征观测，对其农艺性状和产量的各指标进行测定。目前针对个体水平的高异黄酮含量红三叶选育研究较少，本研究通过比较红三叶农艺性状、产量、药用成分之间的差异，为红三叶高产优质栽培和品种选育提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验区概况

红三叶材料取自内蒙古自治区呼和浩特市和林格尔县大唐药业试验地(40°48′N,114°43′E)。试验地海拔1 060 m，属于中温带半干旱大陆性季风气候，年平均气温6.2℃左右，早晚温差较大，四季分明，具备良好灌溉条件。种植于2019年5月，于2021年6月以行距和株距均70 cm进行单株移栽，以10株×10株为一个小区，以便对每株红三叶表型特征进行观测以及各项指标的测定。

1.2 红三叶异黄酮含量测定

于红三叶开花期，在大田中随机选取300株红三叶植株，使用等吸光点紫外分光光度法对其异黄酮含量进行测定[18]。

1.3 红三叶农艺性状测定

对不同异黄酮含量的红三叶群体于次年初花期和盛花期，使用卷尺测量其绝对株高和自然株高，3次重复[19]；用卷尺测定其自然状态下的冠幅，重复3次，取其均值。每隔15天测定红三叶绝对株高，计算其生长速度计算公式为：s=(l2-l1)/(t2-t1)。其中，t1和t2分别为测定前后两次的时间，l1和l2分别为测定前后两次的绝对株高[20]。使用叶面积仪对测定红三叶叶面积[21]，3次重复。测定红三叶叶重，计算其占总重的百分比，即为叶率。

1.4 红三叶产量测定

对不同异黄酮含量的红三叶群体于生长旺盛期，留茬高度3～5 cm刈割取样，立即称重，即为鲜重[22]，3次重复；将鲜草放入烘箱中，100oC烘干6 h，称其重，3次重复，并计算鲜干比。

1.5 数据分析

使用R,Microsoft Excel,Spass Statistics 23软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 红三叶异黄酮含量测定

对300株红三叶植株(H1～H300)异黄酮含量进行测定，异黄酮含量的范围为15.65～34.16 mg·g-1。其中，H1异黄酮含量最高(34.16 mg·g-1)，H300异黄酮含量最低(15.65 mg·g-1)，平均异黄酮含量为24.88 mg·g-1。为深入探索不同异黄酮含量红三叶个体间的共性，对300株红三叶异黄酮含量进行K-means聚类分析(图1)，将其聚类为4个红三叶群体(T1～T4)。其中，T1包含红三叶个体H1～H56，占据18.67%，异黄酮含量为28.17～34.16 mg·g-1，此群体中红三叶异黄酮含量较高；T2包含红三叶个体H131～H199，占据23.00%，其异黄酮含量为23.10～24.99 mg·g-1；T3包含红三叶个体H57～H130，占据24.66%，其异黄酮含量为25.14～27.86 mg·g-1；T4包含红三叶个体H200～H300，占据33.64%，其异黄酮含量为15.65～22.93 mg·g-1，此群体中红三叶异黄酮含量较低(表1)。

图1 红三叶个体水平异黄酮含量聚类分析图

表1 4个红三叶群体的异黄酮含量

2.2 不同异黄酮含量红三叶形态特征观测

红三叶为异花授粉植物，由于其配子不亲和性导致其表型变异类型众多[17]，为探索异黄酮含量与红三叶形态特征间的关系。对大田中红三叶的表型特征进行观测，发现红三叶个体间叶片面积(M)及自然株高(L1)和绝对株高(L2)差值具有明显差异。统计这两个指标在T1～T4类型中的占比(表2)，发现高异黄酮含量红三叶群体(T1)中L1-L2大于15 cm的个体占55.9%，大多表现为平卧型。低异黄酮含量红三叶(T4)群体中，L1-L2介于7～15 cm的个体占53.9%，此类红三叶株型大多表现为半直立型。高异黄酮含量红三叶(T1)中叶片面积小于350 mm2占71.4%，低异黄酮含量红三叶(T4)中叶片面积大于350 mm2占53.4%。T1、T2、T4群体中叶片面积小于350 mm2的红三叶个体所占比例均更高，也可能是由于该大田红三叶中叶片面积小于350 mm2的个体更多的原因而导致。

表2 4个红三叶群体不同表型占比

2.3 不同异黄酮含量红三叶农艺性状比较

对4个红三叶群体农艺性状的各指标进行分析，结果如表3所示。4个红三叶群体样品中，初花期自然株高范围为17.39～21.45 cm，盛花期自然株高范围为20.50～29.45 cm。T4在初花期和盛花期两个时期的自然株高最高(21.45 cm，29.45 cm),T3在两个时期自然株高最低(15.93 cm，20.50 cm)。红三叶样品中初花期绝对株高范围为27.20～33.68 cm，盛花期绝对株高范围为38.93～44.49 cm。T4初花期的绝对株高最低(27.20 cm)，T3盛花期绝对株高最低(38.93 cm),T1初花期和盛花期绝对株高最高(33.68 cm，44.49 cm),4个红三叶群体初花期冠幅范围为43.28～50.37 cm，盛花期冠幅范围为57.71～69.22 cm，T4在两个时期冠幅最小(43.28 cm，57.71 cm)，T1初花期冠幅最大(50.37 cm)，T3盛花期冠幅最大(69.22 cm)，4个类型红三叶中T4生长速度最快(0.95 cm·d-1)，T2生长速度最慢(0.75 cm·d-1)(P<0.05)。4个红三叶群体叶率范围为48%～70%，T1叶率显著最高为70%(P<0.05)，T1群体平均叶面积显著最小为317.07 mm2，T4平均叶面积显著最大为477.92 mm2(P<0.05)，T2和T3叶面积无显著差异。

表3 红三叶农艺性状比较

2.4 不同异黄酮含量红三叶草产量比较

4个红三叶群体中单株草产量存在显著性差异(P<0.05)，结果如表4所示，4个红三叶群体单株鲜草产量范围为317.59～388.77 g，T1单株鲜重最重(388.77 g)，T2单株鲜重最轻(317.59 g);4个群体干重范围为91.18～118.32 g，T1干重最重(118.32 g)，T2单株干重最轻(91.18 g)；鲜干比范围为3.29～3.79，T4鲜干比最高(3.79)，T1鲜干比最低(3.29)；T1,T3,T4鲜重显著高于T2(P<0.05)。T1干重显著高于其他类型(P<0.05)。T1鲜干比显著低于T2,T3,T4群体(P<0.05)，表明T1累积干物质能力较强，而T4较弱。

表4 红三叶草产量比较

2.5 各指标间相关性分析

不同异黄酮含量的红三叶类群各项生长指标与产量的相关性分析结果如表5所示，初花期自然高度和同时期绝对株高、冠幅、叶片面积都呈显著负相关(P<0.05),与盛花期冠幅呈极显著负相关(P<0.01)；初花期绝对高度与同时期冠幅及鲜干比呈极显著正相关(P<0.01)，与叶率呈显著正相关(P<0.05)，与叶片面积呈显著负相关(P<0.05)；生长速度和鲜重呈极显著正相关(P<0.01)，红三叶叶率与异黄酮含量呈极显著正相关(P<0.01)，叶片面积与干重和异黄酮含量呈显著负相关(P<0.05)。叶率和叶片面积对异黄酮含量具有一定影响，叶片面积对红三叶干重具有一定影响，而生长速度对红三叶鲜重具有一定影响。因此，不同异黄酮含量的红三叶对其草产量以及各项生长指标影响较大。

表5 各指标间相关性分析

3 讨论

红三叶异黄酮也被称为“天然的雌激素”，目前红三叶中已知的异黄酮化合物以芒柄花黄素、鹰嘴豆牙素、大豆苷元、染料木素为主[23]。女性绝经后所要经历的潮热现象最有效的治疗方法即添加外源雌激素[8]，而红三叶异黄酮便可代替此类外源雌激素[24]。马勇等[25]研究表明红三叶异黄酮可改善去卵巢大鼠内源激素不平衡的状况、子宫形态结构和生理机能。本研究随机选取大田中300株红三叶，测定其地上部分的异黄酮含量。发现：大田中红三叶异黄酮含量最高为34.16 mg·g-1，最低为15.65 mg·g-1，平均含量为24.88 mg·g-1，平均含量高于岷山县红三叶异黄酮含量。以异黄酮含量为依据，对300株红三叶进行K-means聚类分析，可将其聚类为4个红三叶类群(T1～T4)，其中T1约占18.67%、T2约占23.00%、T3约占24.66%、T4约占33.67%。

表型性状受自身遗传特性及环境因子共同影响，广泛用于遗传变异和多样性、良种选育等研究中[13,26]，具有观察明显、调查简便等优点[27]。由于红三叶自交不亲和的特性，红三叶在栽培过程会出现大量的表型变异，这为利用表型标记选育红三叶优良品种提供了基础[28]。本研究对不同异黄酮含量红三叶群体进行形态观测，利用其形态学差异，为选育高异黄酮含量红三叶新种质提供可行途径。研究发现，大田中红三叶的株型和叶面积存在明显不同，将红三叶自然株高和绝对株高差值分为3个等级以对应不同株型，叶片面积分为2个等级对应大叶型和小叶型红三叶。发现直立型红三叶在4个群体中所占比例接近；半直立型红三叶在T4中所占比例最高为53.90%，在T1、T2、T3中所占比例接近；平卧型在T1中所占比例最高为55.9%，在T4中所占比例最低为23.00%；平均叶片面积小于350 mm2的红三叶植株在T1中占71.40%、T2中占74.60%、T3中占44.40%、T4中占53.80%，平均叶片面积大于350 mm2红三叶植株在T1中占28.60%、T2中占25.40%、T3中占55.60%、T4中占46.20%。这也可能是大田中平卧型和小叶型红三叶占据比例更高的原因所导致，还有待后续深入研究。

鲜干比是反映牧草适口性的重要指标[29]，株高、冠幅、生长速度等农艺性状是评价饲草生产性能的重要指标，直接影响饲草产量，本研究结果表明高异黄酮含量红三叶类型(T1)的叶率显著高于T2,T3,T4(P<0.05)。T1的干重显著高于T2,T3,T4(P<0.05)，鲜干比也显著最低(P<0.05)，说明T1积累干物质能力更强。使用相关分析发现，叶片面积对红三叶干重影响较大，而生长速度对红三叶鲜重影响较大，叶率对红三叶异黄酮含量影响较大(P<0.01)。马一鸣[17]测定红三叶各器官中的异黄酮含量，研究结果表明叶片中异黄酮含量最高，与本研究叶率对异黄酮含量影响较大的结果也基本一致。

4 结论

本研究测定大田中300株红三叶异黄酮含量，通过田间形态观测，发现高异黄酮含量红三叶大多具有绝对高度和自然高度差值大于15 cm、叶片面积小于350 mm2的特征，同时也具有更高的草产量。高异黄酮含量的红三叶类群绝对株高和冠幅最大(P<0.05)。通过相关性分析发现叶率对红三叶植株异黄酮含量影响较大。