阴道微生物菌群分布特征与IVF-ET妊娠结局的相关性

周欣业 黄晓帆 王丽蔓 郭少丽 吴淑卿

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）目前已成为不孕症患者辅助生殖助孕的主要手段，但其妊娠成功率受患者年龄、身心状态、胚胎质量、激素分泌、子宫等多种因素的综合影响，部分患者需增加治疗周期，造成患者承重的心理压力及经济负担［1］。女性生殖道是人体重要的微生态系统之一，约70%的女性阴道微生物群主要由乳杆菌组成，其可通过产生乳酸、过氧化氢等抑制外来细菌的生成，同时其特异蛋白质可降低有害微生物的黏附，从而维持阴道的健康状态［2］。当受到致病菌侵入、激素含量变化等因素的影响时，阴道PH 值将发生改变，其保护作用和抵抗作用受到破坏，导致局部菌群失衡，甚者可扩散至子宫，引起相应部位炎症反应［3］。既往研究表明，阴道微生物群失调与不孕症、反复流产、胎膜早破及新生儿早产等不良妊娠结局密切相关［4-5］。本研究分析不同妊娠结局患者阴道微生物分布特征及其与妊娠结局的相关性，以期寻找IVF-ET 不良妊娠结局的潜在生物标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年10月至2021年10月汕头市中心医院生殖医学中心82 例IVF-ET 患者为研究对象。纳入标准：①确诊为原发性不孕症［6］，且选取IVF-ET 方案者；②年龄＜40 岁；③移植当天胚胎均为优质胚胎；④自愿参与并签署知情同意书者；⑤配合随访者。排除标准：①伴有其他可造成胚胎种植失败的内科疾病；②伴有内分泌异常相关疾病，如多囊卵巢综合征、甲亢、甲减等；③中重度子宫内膜异位症；④慢性子宫内膜炎；⑤子宫占位性病变或子宫腔形态异常。本研究已通过汕头市中心医院医学伦理委员会的审查与批准。对82 例患者进行随访，根据IVF-ET妊娠结果分为IVF-ET妊娠成功组（妊娠组，n=50）和妊娠失败组（非妊娠组，n=32）。两组基本资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），有可比性。见表1。

表1 两组基本资料比较（±s）Table 1 Comparison of basic data between the two groups（±s）

表1 两组基本资料比较（±s）Table 1 Comparison of basic data between the two groups（±s）

组别妊娠组非妊娠组t 值P 值n 50 32年龄（岁）33.12±2.84 32.05±3.41 1.538 0.128 BMI（kg/m2）22.74±3.25 23.54±3.95 0.999 0.321不孕年限（年）3.66±2.05 4.01±2.65 0.672 0.504移植前子宫内膜厚度（mm）8.72±1.21 8.52±1.06 0.765 0.446移植胚胎数目（个）1.66±0.35 1.55±0.24 1.557 0.123

1.2 方法

1.2.1 阴道分泌物采集

患者取膀胱截石位，于胚胎移植前，使用一次性无菌棉拭子（江苏康健医疗用品有限公司），伸至阴道后窟窿部位，上下左右转动棉签，吸取充分阴道分泌物取出，同时采集三个平行标本，加入50%的灭菌甘油3 mL，-80℃低温保存。

1.2.2 DNA 提取

将装有阴道分泌物的离心管置于离心机，8 000 r/min 离10 min（离心半径15 cm），弃上清，一次加入500 μL 缓冲液A、20 μL 的蛋白酶K、500 μL 缓冲液B、500 μL 无水乙醇等，12 000 r/min离心2 min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。再次置于离心机，12 000 r/min 离心2 min（离心半径15 cm），室温晾干后加40 μL 洗脱液，将溶液收集到离心管中。

1.2.3 PCR 扩增和高通量测序

以16S rRNAV46 保守区为靶点，上游引物：5＇-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3＇，下游引物：5＇-AYTGGGYDTAA AGNG-3＇进行PCR 扩增，以2%琼脂糖凝胶电泳进行分离，采用凝胶回收试剂盒（AXYGEN 公司）对目的片段行胶回收，PCR 扩增产物进行荧光定量，采用凝胶电泳进行质检。最后按照每个样本的测序量要求进行相应比例的混合，利用Illumina 公司的Miseq2000 平台进行高通量测序，分析阴道菌群结构组成。

1.3 观察指标

α-多样性常通过Shannon 指数和Simpson 指数反映微生物菌落，其指数值与群落的多样性呈正比的关系［7］。β-多样性主要通过偏最小二乘法判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）观察两样本之间的差异［8］。

1.4 统计学分析

采用Graph Pad Prism 7.00 和SPSS 21.0 统计软件进行数据分析和图表绘制。计量资料以（）表示，采用t检验比较各组间差异；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验比较各组间差异，多因素Logistic 回归分析明确不良妊娠结局的危险因素，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组阴道微生物群α-多样性和β-多样性分析

妊娠组的Shannon 指数为（1.25±0.77），非妊娠组为（1.85±1.11）；妊娠组的Simpson 指数为（0.41±0.22），非妊娠组为（0.55±0.25），非妊娠组Shannon指数和Simpson 指数均高于妊娠组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。经PLS-DA 分析显示，妊娠组与非妊娠组之间的阴道微生物群落存在差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 两组阴道微生物群α-多样性Figure 1 α-diversity of vaginal microbiota in two groups

图2 两组阴道微生物群β-多样性Figure 2 β-diversity of vaginal microbiota in two groups

2.2 两组阴道微生物群落在属水平上的相对丰度比较

妊娠组乳酸杆菌属高于非妊娠组，而加德纳菌属、奇异菌属、纤毛菌属、普雷沃菌属、双歧杆菌属、脲原体属、棒状杆菌、链球菌等均低于非妊娠组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组阴道微生物群落在属水平上的相对丰度比较Table2 Comparisonofrelativeabundanceofvaginal microbial communities at the genus level between the two groups

2.3 阴道微生物群与妊娠结局的logistics 回归分析

阴道微生物群中，加德纳菌属、奇异菌属、纤毛菌属、普雷沃菌属、脲原体属过度生长是影响IVF-ET妊娠结局的独立危险因素，乳酸杆菌属增多则是其保护性因素，差异均用统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 阴道微生物群与妊娠结局的logistics 回归分析Table 3 Logistic regression analysis of vaginal microbiota and pregnancy outcomes

3 讨论

近年来，随着环境恶化、人们生育年龄延迟及生活压力的影响，不孕症发病率有逐年增长趋势，尽管辅助生殖技术使得临床生育率有所增长，但如何提高助孕的临床妊娠成功率仍是生殖医学领域关注热点［9］。随着微生物测序技术的发展，对于阴道菌群与相关疾病的相关研究也逐步深入。有报导显示，不孕症妇女与正常生育妇女的阴道菌群分布存在显著差异［10］。当微生物侵入女性生殖道引起上行感染时，可导致子宫及输卵管炎症，出现输卵管堵塞或破坏、内膜瘢痕形成等，最终导致卵管性不孕症［11］。

本研究结果说明，IVF-ET 不同妊娠结局患者间的阴道微生物群落存在差异，表现为非妊娠患者阴道微生物群多样性高于妊娠患者。此外，经多样性对比分析发现，非妊娠组患者加德纳菌属、奇异菌属、纤毛菌属等过度生长，乳酸杆菌属丰度显著降低。因此考虑阴道微生物群紊乱可能影响IVF-ET 胚胎着床及受孕过程，且其妊娠结局可能与乳杆菌丰度降低，厌氧菌丰度升高相关。原因可能是IVF-ET 过程中，阴道微生物群或潜在致病菌随植入胚胎导管进入子宫内，这些微生物代谢可能诱导子宫内膜上皮细胞中关键的细胞通路，从而影响着床和妊娠结局［12］。国外Babu G 等［13］也研究发现，与不孕症患者比较，健康女性阴道微生物群主要以乳酸杆菌属为优势菌群，而不孕症患者则为假丝酵母菌属、肠球菌属等细菌性阴道病相关菌群含量升高。

本研究通过logistics 回归分析提示IVF-ET妊娠结局与乳酸杆菌减少和厌氧微生物增加密切相关。考虑原因有：①乳酸杆菌在维持阴道稳态中发挥重要作用，一方面，其可通过与阴道上皮细胞的粘附，形成抵抗病原体粘附的物理屏障，对其他致病菌形成竞争抑制作用［12］；另一方面，其可维持阴道酸性环境稳态（PH 3.5-4.5），能够灭活或杀死多种病原体，同时通过分泌过氧化氢等代谢产物，进而增加病原体对抗生素的敏感性［13］。②当阴道加德纳菌属、普雷沃菌属、奇异菌属等厌氧菌取代了乳酸杆菌的优势后，分泌的阴道溶毒素可裂解阴道上皮细胞，从而使胚胎着床内环境遭到破坏［14］。此外，加德纳菌属、普雷沃菌属产生的神经氨酸酶会可使宫颈上皮细胞异常，导致宫颈和阴道屏障变弱，进而增加了病原菌上升感染的风险［15］。因此可见，临床在IVF-ET 前可考虑恢复患者乳杆菌为主的阴道环境，同时注意IVF-ET 操作过程中取卵及移植对阴道微生物菌群的影响，以维持宫腔内环境，改善患者妊娠结局［16-17］。

综上所述，阴道微生物群与IVF-ET 患者的妊娠结局存在密切联系，IVF-ET 妊娠失败患者阴道微生物群以乳酸杆菌减少和厌氧微生物过度生长为主要特征，且可能是IVF-ET 妊娠失败的潜在预测指标，但对其作用机制仍需后续进一步深入探讨。