桂枝茯苓丸联合西医药物治疗多囊卵巢综合征的疗效及对PI3K/AKT/mTOR通路的调节作用

李建南 于凤英 沈欢欢 张莉

多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是临床常见的生殖内分泌疾病，以排卵障碍、胰岛素抵抗、高雄激素血症为主要特征，常见的临床表现包括排卵障碍导致的月经稀发及不孕、胰岛素抵抗导致的肥胖及糖耐量异常、高雄激素导致的多毛及痤疮等，西医药物治疗手段主要为促排卵、改善胰岛素抵抗等［1-2］。中医认为PCOS的病机在于“痰瘀互结、滞碍冲任”，出自《金匮要略》的经典名方桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、丹皮、桃仁、芍药组成，能够针对PCOS 的中医病机起到温经通络、化痰利水的功效［3-4］。已有临床研究报道，桂枝茯苓丸用于PCOS、无排卵型月经不调等妇科疾病的治疗能够促进排卵、调节性激素分泌［5-6］；有基础研究报道，桂枝茯苓丸用于PCOS 大鼠的治疗通过激活PI3K/AKT/mTOR通路的方式改善胰岛素抵抗［7］。本研究将从胰岛素抵抗及PI3K/AKT/mTOR通路的角度进一步分析桂枝茯苓丸用于PCOS 临床治疗的价值，旨在为桂枝茯苓丸治疗PCOS 的推广使用积累更多的循证医学证据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2020年2月至2021年10月期间本院妇科门诊收治的92 例PCOS 患者作为研究对象。纳入标准：①符合PCOS 诊断标准［8］；②年龄18～45岁；③受试者均签署知情同意书；排除标准：①先天性生殖器官发育异常者；②合并糖尿病、甲状腺疾病、性腺原发或继发性疾病等内分泌疾病；③对研究所用药物过敏或存在禁忌症。剔除及脱落标准：①在研究期间失访的患者；②在治疗过程中因其他疾病需进行其他治疗；③不遵医嘱治疗的患者。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 分组方法

按照随机数字表将患者分为观察组和对照组，每组各46 例。观察组平均（33.51±6.51）岁，PCOS 病史（平均3.32±0.62）年，体质量指数（BMI）（28.85±5.41）kg/m2，研究过程中剔除及脱落3 例；对照组年龄平均（33.94±6.28）岁，PCOS 病史平均（3.41±0.71）年，体质量指数（BMI）（28.44±5.73）kg/m2，研究过程中剔除及脱落2 例。两组患者一般资料的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3 治疗方法

两组患者均参照指南进行生活方式干预、调整月经周期、调整代谢等治疗。调整月经周期方法如下：月经第5 d 开始予以炔雌醇环丙孕酮片2.035 mg/次、1 次/日、连续口服21 d，停药后待月经来潮第5 d 再次治疗；调整代谢方法如下：盐酸二甲双胍片0.5 g/次、3 次/日、口服；连续治疗6 个月经周期。观察组患者在上述治疗的基础上加用桂枝茯苓丸6 g/次、2 次/日、口服，连续治疗6 个月经周期。

1.4 疗效评价方法

治疗后6 个月时参照《24 个专业105 个病种中医诊疗方案（试行版）》［9］评价疗效，显效为月经周期恢复正常、恢复排卵、性激素指标正常，有效为月经周期基本恢复正常、有排卵但不规律、性激素指标较治疗前改善，无效为无正常月经周期、无排卵、性激素指标无明显改善。总有效率=［（显效例数+有效例数）/总例数］×100%。

1.5 B 超检测

治疗过程中，于月经周期第10 天采用B 超监测卵泡，卵泡直径＜10 mm、每隔3 d 监测1 次，10～15 mm、每隔2 d 监测1 次，15～18 mm、每隔1 d 监测1 次，≥18 mm、每天监测1 次，直至观察到优势卵泡直径缩小5 mm 以上、判断为排卵，计算排卵率=排卵周期数/B 超监测周期数×100%［8］。治疗前及治疗后6 个月时，分别采用B 超检测双侧卵巢体积。

1.6 血清指标检测

治疗前及治疗后6 个月时进行血清指标检测，分别采集空腹肘静脉血3～5 mL，静置30 min 后离心分离血清，采用化学发光免疫法检测黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睾酮（T）、胰岛素（FINS）的水平，计算胰岛素抵抗指数HOMA-IR=［FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）］/22.5［8］。

1.7 外周血指标检测

治疗前及治疗后6 个月时进行外周血指标检测，分别采集空腹肘静脉血3～5 mL，采用Ficoll 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，离心半径5 cm、转速3 000 g、时间10 min，加入细胞裂解液提取外周血单个核细胞的蛋白，检测蛋白浓度后将含有20 μg 蛋白的样本在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳、分离不同分子量的蛋白，电转移至硝酸纤维素膜后在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，而后在p-PI3K一抗（1∶1 000）、p-AKT 一抗（1∶1 000）、p-mTOR一抗（1∶1 000）及β-actin 一抗（1∶5 000）中4℃孵育过夜。第二天，在二抗（1∶2 000）中室温孵育1 h。最后，将硝酸纤维素膜放入凝胶成像系统，采用电化学发光法显影得到蛋白条带，以β-actin 为内参、计算p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的表达水平。

1.8 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计数资料以n（%）表示、采用χ2检验。计量资料以（）表示、采用t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗效果的比较

治疗后6 个月时，观察组患者的治疗总有效率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 两组患者治疗效果的比较［n（%）］Table 1 Comparison of treatment effects between the two groups［n（%）］

2.2 两组患者治疗前后B 超监测排卵情况及卵巢体积的比较

治疗的6个月中，观察组患者的排卵率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗前，2 组患者的双侧卵巢体积比较，差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后6 个月时观察组患者的双侧卵巢体积均小于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 两组患者治疗前后B 超监测排卵情况及卵巢体积的比较（±s）Table 2 Comparison of ovulation and ovarian volume monitored by B-ultrasound before and after treatment between the two groups（±s）

表2 两组患者治疗前后B 超监测排卵情况及卵巢体积的比较（±s）Table 2 Comparison of ovulation and ovarian volume monitored by B-ultrasound before and after treatment between the two groups（±s）

组别观察组对照组χ2/t 值P 值n 43 44排卵率201/256 182/260 4.889 0.027左侧卵巢体积（cm2）治疗前9.41±0.95 9.49±1.02 0.378 0.706治疗后6.37±0.77 7.81±0.93 7.857 0.000右侧卵巢体积（cm2）治疗前9.52±0.98 9.70±1.05 0.839 0.404治疗后6.45±0.83 7.79±0.94 7.042 0.000

2.3 两组患者治疗前后血清性激素水平的比较

治疗前，2 组患者的血清LH、FSH、T 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后6 个月时，观察组患者的血清LH、FSH、T 水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 两组患者治疗前后血清性激素水平的比较（±s）Table 3 Comparison of serum sex hormone levels between the two groups before and after treatment（±s）

表3 两组患者治疗前后血清性激素水平的比较（±s）Table 3 Comparison of serum sex hormone levels between the two groups before and after treatment（±s）

注：与观察组比较，aP＜0.05。

组别观察组对照组治疗前治疗后t 值P 值治疗前治疗后t 值P 值n 43 43 44 44 LH（U/L）12.47±1.58 7.04±0.85 14.582 0.000 12.88±1.84 8.85±1.25a 10.039 0.000 FSH（U/L）4.92±0.62 3.89±0.52 11.039 0.000 4.96±0.71 4.31±0.44a 8.382 0.000 T（ng/dL）81.94±11.34 44.31±7.82 16.482 0.000 82.44±12.09 58.74±8.45a 9.597 0.000

2.4 两组患者治疗前后胰岛素抵抗程度的比较

治疗前，2 组患者的FBG、FINS、HOMA-IR 水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后6 个月时，两组患者的FBG、FINS、HOMA-IR 水平均较治疗前降低（P＜0.05）；观察组患者的FBG、FINS、HOMA-IR 水平低于对照组（P＜0.05）。见表4。

表4 两组患者治疗前后胰岛素抵抗程度的比较Table 4 Comparison of insulin resistance between the two groups before and after treatment

2.5 两组患者治疗前后外周血PI3K/AKT/mTOR通路的比较

治疗前，2 组患者外周血p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后6 个月时，两组患者外周血p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的表达水平均较治疗前升高（P＜0.05）且观察组患者外周血p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平高于对照组（P＜0.05）。见表5。

表5 两组患者治疗前后外周血p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平的比较（±s）Table 5 Comparison of the expression levels of p-pi3k,p-Akt and p-mTOR in peripheral blood between the two groups before and after treatment（±s）

表5 两组患者治疗前后外周血p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平的比较（±s）Table 5 Comparison of the expression levels of p-pi3k,p-Akt and p-mTOR in peripheral blood between the two groups before and after treatment（±s）

注：与观察组比较，aP＜0.05。

组别观察组对照组n 43 43 t 值P 值44 44 t 值P 值时间治疗前治疗后治疗前治疗后p-PI3K 0.23±0.07 0.45±0.08a 17.831 0.000 0.25±0.05 0.84±0.12a 24.582 0.000 p-AKT 0.36±0.06 0.54±0.08a 13.011 0.000 0.30±0.04 0.72±0.12a 19.392 0.000 p-mTOR 0.48±0.06 0.72±0.10a 13.185 0.000 0.45±0.07 1.27±0.16a 21.364 0.000

3 讨论

PCOS 是育龄期女性不孕的常见病因，患者多合并肥胖、胰岛素抵抗及高雄激素血症。目前PCOS 的发病机制未完全明确，相关研究认为胰岛素抵抗在疾病的发生中起重要作用，胰岛素抵抗造成的高胰岛素血症不仅影响糖脂代谢、引起肥胖的发生，还能够刺激LH 释放增加、阻碍卵泡发育并导致卵巢体积增加、出现多囊卵巢［10］；同时也会抑制性激素结合球蛋白生成并导致游离T 水平升高，进而导致高雄激素相关的多毛、痤疮等组织［11］。因此西医治疗PCOS 的常用手段包括生活方式干预、增加胰岛素敏感性、调节月经及促排卵等，但整体疗效并不尽如人意。

近些年中药方剂治疗PCOS 的价值受到越来越多关注，该病属于中医“月经过少”、“月经后期”、“闭经”等范畴，中医病机在于“痰瘀互结、滞碍冲任”，痰瘀可存在于人体各个部位，发生于卵巢则为“痰瘀阻滞胞宫”，有学者认为PCOS 可称为“胞中脂膜壅塞诸症”，治疗应遵循化痰祛瘀的原则［12］。出自《金匮要略》的桂枝茯苓丸中桂枝能够温阳化气、茯苓能够健脾化痰，辅助以白芍、牡丹皮、桃仁共奏化痰、化瘀、利水之功效。目前桂枝茯苓丸的临床应用范围包括PCOS、盆腔炎性疾病、痛经等血瘀证，国内学者的临床研究报道了桂枝茯苓丸治疗PCOS能够调节性激素［13］；另有基础研究证实桂枝茯苓丸显著改善PCOS 大鼠的排卵障碍及胰岛素抵抗［7，14］，但该药物的上述改善作用尚缺乏临床研究证据。

根据桂枝茯苓丸治疗PCOS 大鼠的相关动物实验结果，激活PI3K/AKT/mTOR 信号通路是桂枝茯苓丸改善排卵障碍及胰岛素抵抗的相关分子机制［7，14］。PI3K/AKT/mTOR 通路是体内介导胰岛素信号转导的重要通路之一，通路中的信号分子发生级联放大的磷酸化能够保证胰岛素正常发挥生物学效应、维持正常的胰岛素敏感性［15］。与此同时，卵巢中的PI3K/AKT/mTOR 通路还调控颗粒细胞的增殖、对卵泡发育具有促进作用［16］。目前的基础研究证实桂枝茯苓丸激活PI3K/AKT/mTOR 通路，与该药物改善排卵障碍及胰岛素抵抗的治疗价值吻合。本研究对PCOS 患者外周血中该信号通路的分子表达水平进行了检测，结果显示：使用桂枝茯苓丸治疗的患者p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的表达水平较高，表明激活PI3K/AKT/mTOR 通路可能是桂枝茯苓丸发挥PCOS 治疗价值的分子机制。

综上所述，桂枝茯苓丸联合西医药物治疗PCOS 能够改善疗效、促进排卵、调节性激素水平及胰岛素抵抗，激活PI3K/AKT/mTOR 通路可能是与之相关的分子机制。