CTLA-4基因多态性及其相关蛋白与原发性胆汁性胆管炎的相关性

冯婧 黄祎 王琴 黄山★

原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）又称原发性胆汁性肝硬化，是一种慢性以女性为主的炎症性和胆汁淤积性肝病，其特征是中小型肝内胆管受到自身免疫性破坏，临床上多以血清中碱性磷酸酶升高和抗线粒体抗体M2亚型阳性为主要特点［1］。PBC 是一种具有明显遗传易感性的自身免疫性肝病。从遗传学的角度分析，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与多种自身免疫疾病相关，它包括基因的编码序列、基因的非编码区和基因之间的基因间区域。由于SNP 引起相关蛋白结构发生改变，进而影响自身免疫性疾病的发生发展。细胞毒性T 淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen 4，CTLA-4）是编码T 细胞调节、激活和抑制蛋白的基因，被认为是许多自身免疫性疾病的候选基因，已有多个基因多态性报道，其中包括rs231775 和rs3087243 和［2-4］。CTLA-4基因编码常见的蛋白有两种：CTLA-4 与可溶性CTLA-4（soluble cytotoxic T lymphocyte antigen 4，sCTLA-4）［3］。有研究显示，某些自身免疫性疾病（如Graves'病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮）与CTLA-4的分子变异有关［2-4］。本研究拟探讨CTLA-4基因多态性、CTLA-4 及sCTLA-4 与PBC的关系，为诊断PBC 寻找新的血清学指标。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019年10月至2021年10月重庆市中医院PBC 患者共78 例，其中男10 例，女68 例，平均年龄（62.19±10.04）岁，入组标准：PBC 诊断依据2017年欧洲肝病学会临床实践指南［5］；健康组60名来自同期本院的健康体检者，其中男9 名，女51名，平均年龄（62.27±12.43）岁。排除标准：①合并其他自身免疫性疾病者；②诊断为其他肝胆疾病者；③合并恶性肿瘤等疾病。两组年龄、性别之间差异无统计学意义（P>0.05）。两基因位点的各基因型频率分布符合Hardy-Weinbery 遗传平衡检验（P>0.05），所得数据具有良好的群体代表性。所有患者或家属知情同意，本实验通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 rs231775、rs3087243 位点SNP 检测

采集静脉血5 mL，以3 000 r/min 速度（离心半径为10 cm）离心10 min，分离血清，留存血细胞均于-80℃冻存备用。①采用上海生工公司血液基因组Ezup 柱式DNA 抽提试剂盒，提取血液中的基因组DNA，操作按照试剂盒说明书进行。②参照NCBI GeneBank 数据获取2 个基因多态性位点的序列，设计待测SNP 位点的聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增引物，rs231775 上游引物：5＇-CCC ACG GCT TCC TTT CTC-3＇，下游引物：5＇-TAC CTG GCG CTC TGT TCT G-3＇，产物534 bp。rs3087243 上游引物：5＇-TTC ATT CAG TAT CTG GTG GAG-3＇，下游引物：5＇-TGA GAA AGC AGG CGG TAA-3＇，产物283 bp。采用上海生工公司Taq PCR Mix 预混液（2×，含蓝染料）试剂盒，使用25 μL 反应体系在BIO-RAD CFX Connect PCR 仪器上进行PCR 反应，具体反应条件如下：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行35 次循环，72℃终延伸10 min，反应终止后4℃保存。③采用海生工公司DNA 分子量标准Marker（100～600 bp），对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。④rs231775、rs3087243 目的基因扩增结束后，使用第一代基因检测技术检测SNP（目的基因正向一代测序由武汉金开瑞生物公司完成）。

1.2.2 CTLA-4、sCTLA-4 的检测

对上述冻存血清，采用酶联免疫吸附法（试剂盒购买自上海江莱生物）检测CTLA-4、sCTLA-4，操作按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 进行统计学处理；计量资料进行方差齐性分析，若方差齐，以（）描述，进行t检验分析，若方差不齐以M（P25～P75）描述，进行非参数秩和检验分析；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；多态性位点的基因型、等位基因与患病的风险分析采用非条件Logistic 回归计算比数比（odds ratio，OR），以OR及95%CI表示相对风险度；相关性采用Spearman 分析；采用受试者工作特征曲线（ROC）对诊断效能进行评价；以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs231775、rs3087243 扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳及测序

rs231775、rs3087243 经PCR 扩增后目的基因为分别为534 bp、283 bp，对目的基因进行2%琼脂糖凝胶电泳后见图1；rs231775、rs3087243目的基因进行正向位点测序，各基因型图谱。见图2。

图1 扩增产物2%琼脂糖凝胶电泳Figure 1 2%agarose gel electrophoresis of amplified products

图2 rs231775、rs3087243 正向位点测序图Figure 2 rs231775、rs3087243 forward site sequencing map

2.2 病例组与对照组rs231775、rs3087243 各基因型、等位基因比较

与对照组比较，病例组的rs231775 GG 基因型比例、AG 基因型比例、G 等位基因频率及rs3087243 的GA 基因型比例均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），且四者均能增加PBC 的患病风险（P<0.05）；两组rs3087243 等位基因频率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、2。

表1 病例组及对照组rs231775 各基因型、等位基因比较［n（%）］Table 1 Comparison of genotypes and alleles of rs231775 in case group and control group［n（%）］

2.3 病例组与对照组外周血CTLA-4、sCTLA-4 浓度比较

与对照组比较，病例组外周血的CTLA-4、sCTLA-4 浓度均较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 病例组及对照组rs3087243 各基因型、等位基因比较［n（%）］Table 2 Comparison of genotypes and alleles of rs3087243 in case group and control group［n（%）］

表3 病例组与对照组外周血CTLA-4、sCTLA-4 浓度比较［（±s），M（P25～P75）］Table 3 Comparison of CTLA-4 and sCTLA-4 concentrations in peripheral blood between case group and control group［（±s），M（P25～P75）］

表3 病例组与对照组外周血CTLA-4、sCTLA-4 浓度比较［（±s），M（P25～P75）］Table 3 Comparison of CTLA-4 and sCTLA-4 concentrations in peripheral blood between case group and control group［（±s），M（P25～P75）］

组别病例组对照组t/Z 值P 值n 78 60 CTLA-4（ng/mL）3.66±1.78 6.00±5.09 2.48 0.016 sCTLA-4（ng/mL）0.29（0.00～0.63）0.54（0.00～0.83）-1.13 0.043

2.4 外周血CTLA-4、sCTLA-4 水平与ALT、AST、GGT、ALP 水平的相关性

相关分析显示，外周血CTLA-4 水平与γ-谷氨酰基转移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）水平呈负相关（P<0.05），与丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平均无明显相关性（P>0.05）；sCTLA-4 水平与ALT、AST、GGT 及ALP水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 外周血CTLA-4、sCTLA4 水平与ALT、AST、GGT及ALP 水平的相关性Table 4 Correlation of peripheral blood CTLA-4 levels and sCTLA-4 levels with ALT，AST，GGT and ALP levels

2.5 外周血CTLA-4、sCTLA-4 的诊断效能

根据ROC 曲线分析，CTLA-4 诊断为PBC 的敏感度为0.850、特异度0.714，曲线下面积（AUC）为0.827（95%CI=0.755～0.899）；sCTLA-4 诊断为PBC 的敏感度为0.667、特异度为0.486，AUC 为0.583（95%CI=0.486～0.682）。见图3。

图3 外周血CTLA4、sCTLA-4 对PBC 的诊断效能ROC 曲线Figure 3 ROC curve of diagnostic efficacy of peripheral blood CTLA4 and sCTLA-4 for PBC

3 讨论

PBC 是一种受遗传因素影响较多自身免疫性肝病，其表现出较强的遗传易感性，对同卵双胞胎进行自身免疫性疾病研究，结果显示PBC 的一致性最高［6］。PBC 易感基因主要分为人类白细胞抗原基因和非人类白细胞抗原基因（如CTLTA-4基因）两大类，其基因易感位点大多与免疫调节相关，这表明免疫调节通路紊乱可能在PBC 的发病中起关键作用［7］。

CTLA-4核苷酸大小约为6.2 kb，由4 个外显子和3 个内含子组成。前导肽序列由外显子1 编码，Ig 结构域由外显子2 编码，外显子3 和4 编码分别编码疏水性跨膜区和细胞质结构域。rs231775 也称为CTLA-4+49A/G，其位于CTLA-4第一外显子区域，由于其位点的A 突变为G 引起丙氨酸突变为苏氨酸，从而使CTLA-4 的功能发生了改变［2-3］。rs231775 G 等位基因携带者具有较强的PBC 易感性，这与报道［8-10］一致。rs3087243 亦与多种自身免疫性疾病相关［2-3，11-12］。CTLA-4 CT60（rs3087243）位于CTLA-4基因的3＇端非编码区，虽然CTLA-4 CT60在3＇端非编码区，但它可能会影响mRNA 的终止，从而影响CTLA-4 的剪接，CTLA-4 和sCTLA-4 两种mRNA 剪接形式的比例与rs3087243 不同的基因型有关［12］。但在本研究中，病例组rs3087243 GA 基因型比例高于对照组，但AA 基因型比例和等位基因频率在两组间并没有差异。而有报道［10，12］称rs3087243的A 等位基因是PBC 的保护因素，这可能与地域或人种有差异，但需要大量样本进行验证。

CTLA-4 是一种在调节性T 细胞（regulatory T cells，Treg）上组成性表达的跨膜蛋白，作为一种抑制性受体，它在结构上与CD28 同源，是Ⅰ型糖蛋白跨膜型免疫球蛋白超家族受体［10］。CTLA-4 比CD28 对B7（CD80/CD86）分子有更强的亲和力，并下调T 细胞的功能，CTLA-4 这种下调T 细胞功能的作用，阻止了自身免疫的发生，因此在自身免疫性疾病的易感性中起着关键作用［3］。正常的Treg可以抑制免疫细胞的过度活化，但在WANG 等人［13］的研究中，PBC 模型小鼠下调T 细胞的功能被抑制，从而导致免疫抑制功能较弱。转氨酶是反应肝肝脏功能较敏感的指标，在其他肝脏疾病和在PBC患者中常伴随转氨酶升高［14］，在本研究中，CTLA-4与GGT 存在明显的相关性，这或许能用于PBC 与其他肝脏疾病的鉴别诊断。此外，ROC 曲线分析显示，CTLA-4 对诊断PBC 具有较好的诊断效能。sCTLA-4 亦与自身免疫性疾病相关，sCTLA-4 在静息Treg 中表达占主导地位，它可通过阻断B7（CD80/CD86）相互作用来抑制T 细胞的早期激活［9，15］。sCTLA-4 在PBC 中尚无报道，但在其他自身免疫性疾病中其低于正常对照组［16］，在本研究中，病例组浓度虽然较低，但其对诊断PBC 效能较差。

综上所述，rs231775 的AG 基因型、GG 基因型、G 等位基因以及rs3087243 GA 基因型均能增加PBC 患病风险，此外，CTLA-4 与GGT 具有较强的相关性，其对PBC 具有较好的诊断效能，有望成为PBC 诊断的新指标。但在本研究中由于标本量有限，rs231775、rs3087243 的和CTLA-4、sCTLA-4 在临床实践中的有效性需要大量样本进一步验证。已有报道［15］针对CTLA-4 的融合蛋白用于其他自身免疫性疾病的治疗，后续试验意在研究CTLA-4对CD4+CD25+Treg 细胞的发育和功能影响，为探索PBC 的发病机制和临床治疗提供新思路。