高效液相色谱法同时测定复方赤红颗粒中没食子酸和原儿茶酸含量*

郑小丽，胡晓波，郑志昌，李 明，杨继红，廖尚高

（1.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550001；2.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550001）

复方赤红颗粒为贵州医科大学附属医院名中医王光义教授的经验方，该方由赤芍、川续断、伸筋草、鸡血藤、红花、路路通、牛膝、独活、杜仲、防风、川芎、秦艽、细辛和没药经现代工艺制备而成，有活血化瘀、舒筋活络、抗炎止痛等功效［1-3］，临床多用于治疗风湿痹症、关节疼痛、手脚冰冷等症，疗效较好。为进一步保证制剂质量稳定、使用安全性及临床疗效，本研究中参考文献［4 - 5］，选择制剂中没食子酸和原儿茶酸为定量指标成分，并采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定两者含量，旨在为该制剂的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；SPD-10A型紫外检测器、WML-2006C-4型威玛龙色谱数据工作站、TG332A 型分析天平（精度为0.01 mg），均购于岛津仪器（苏州）有限公司；LIBROR AEL - 160 型电子分析天平（常熟市双杰测试仪器厂，精度为0.1 mg）；HS10260D 型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

复方赤红颗粒（贵州医科大学附属医院，批号分别为20210301，20210302，20210303，规格为每袋10 g）；没食子酸对照品（批号为110831 - 201906，含量91.5%），原儿茶酸对照品（批号为110809-201906，含量97.7%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Elite Supersil ODS - B C18柱（250 mm ×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈-1%醋酸溶液（8∶92，V/V）；流速：0.9 mL/min；检测波长：260 nm；柱温：30 ℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取干燥至恒重的原儿茶酸对照品10 mg，精密称定，加甲醇溶解并定容至10 mL，取1 mL，用甲醇定容至100 mL，得溶液Ⅰ。取干燥至恒重的没食子酸对照品10 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加溶液Ⅰ溶解并定容，即得。

供试品溶液：取样品细粉0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶内，精密加入2%醋酸溶液0.5 mL，再加入乙酸乙酯20 mL，超声（功率260 W，频率40 kHz）20 min，滤过，挥干乙酸乙酯，残渣加2 mL甲醇溶解，滤过，取续滤液，即得。

空白对照溶液：按供试品溶液制备方法制备不加样品的空白对照溶液［6-12］。

2.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.2 项下3 种溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定。空白对照溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱相应保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。详见图1。

图1 高效液相色谱图1.Gallic acid 2.Protocatechuic acid A.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取没食子酸对照品溶液适量，加甲醇稀释成质量浓度分别为50，100，200，400，800，1 600µg/mL 的没食子酸系列对照品溶液；精密量取原儿茶酸对照品溶液，加甲醇稀释成质量浓度分别为2.625，5.250，10.500，21.000，42.000，84.000 µg/ mL的原儿茶酸系列对照品溶液；均按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y没=24 154X没- 453 988（R2= 0.999 8，n= 6）和Y原=38 964X原-12 458（R2=0.999 9，n=6）。结果表明，没食子酸和原儿茶酸质量浓度分别在50～1 600µg/mL 和2.625～84.000µg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果没食子酸和原儿茶酸峰面积的RSD分别为1.79%和1.41%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品（批号为20210301）溶液适量，分别于0，1，2，3，4，5 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果没食子酸和原儿茶酸峰面积的RSD分别为1.35%和1.42%（n= 6），表明供试品溶液室温下放置5 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（批号为20210301）适量，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果没食子酸和原儿茶酸平均含量分别为0.936 8 mg/g和0.043 3 mg/g，RSD分别为0.95%和1.52%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为20210301）适量，共9份，每份约0.25 g，精密称定，分别置100 mL容量瓶内，分别精密加入混合对照品溶液（含没食子酸234.2µg/mL、原儿茶酸10.82 µg/ mL）0.8，1.0，1.2 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取3批样品各适量，平行2份，每份约0.5 g，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品中没食子酸和原儿茶酸的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of the content determination of gallic acid and protocatechuic acid in samples（mg/g，n=2）

3 讨论

3.1 指标性成分选择

复方赤红颗粒由多味中药材组方，成分复杂，目前尚无统一质量标准。没食子酸和原儿茶酸具有抗炎镇痛作用，是治疗风湿痹症的有效成分［13-14］，其含量直接影响该制剂的疗效，故本研究中确定没食子酸和原儿茶酸为该制剂的含量测定指标成分。

3.2 提取溶剂选择

使用不同体积分数的甲醇、乙醇及乙酸乙酯等为提取溶剂，进行筛选和优化。结果显示，以2%醋酸溶液+乙酸乙酯为提取溶剂时，没食子酸和原儿茶酸的提取率均较高，故选择其为提取溶剂。

3.3 超声时间选择

保持提取溶剂不变，考察不同超声时间（10，20，30，40，50，60 min）对结果的影响。结果显示，超声20 min和30 min 的提取率和提取效率基本一致，且均高于40，50，60 min时，从提高工作效率及节约能源方面考虑，确定超声时间为20 min。

3.4 方法评价

本研究中建立的HPLC 法专属性好，分离度高，重复性好，操作简单，结果准确可靠，可用于同时测定复方赤红颗粒中没食子酸和原儿茶酸的含量，并为下一步更有效地控制该制剂的质量提供参考。