钝药野木瓜果实的抗氧化及体外降血糖活性研究*

谢华松，魏爱红，邹玉冰，李龙辉，龙昊邦，张声源，2△

（1.嘉应学院医学院，广东 梅州 514031；2.广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室，广东 梅州 514031）

自由基的化学性质活泼，其引发的氧化损伤可导致如糖尿病、癌症、心脑血管疾病、动脉粥样硬化等许多疾病发生［1-2］。研究表明，天然植物中含有丰富的抗氧化活性物质（黄酮类、多糖、有机酸以及酚类等）［3］，且其中的黄酮类、酚类等成分均具有良好的降血糖作用［4］，部分天然产物中含有降血糖活性的有效成分［5-6］。钝药野木瓜Stauntonia leucanthaDiels ex Y.C.Wu 属木通科野木瓜属植物，俗称绕绕藤、五叶木通、八月瓜，主要分布于贵州、四川、安徽、江浙和两广等地，其入药部位主要为藤茎、叶，味甘性温，具有除湿消痹、活血散瘀、祛风止痛、利水通经等功效［7-9］。近年来，野木瓜属植物被发现含有三萜苷元、苷类、木脂素类、黄酮类、酚类、脂肪酸类、甾醇类等成分，具有镇痛抗炎、抗肿瘤、抗病毒、促进神经细胞生长、抗氧化、放射增敏和驱虫等作用。民间习惯食用钝药野木瓜果实，但国内外对此研究报道较少。为进一步深入挖掘钝药野木瓜果实的食用和药用价值，本研究中拟对广东省梅州山区该果实的果皮、果肉、种子的抗氧化及降血糖作用进行探讨，为其在食药领域的综合开发利用提供科学依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：UV - 1800 型紫外- 可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；Q-Gard A2型超纯水仪（德国Millipore公司）；BT125D 型电子分析天平、BS110s 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；GL-25M 型高速离心机（上海赵迪生物科技有限公司）；JP - 100S 型超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；WJX-A1000型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）；pHSJ - 3F 型pH 计（上海精科仪器有限公司）；DHP -9052型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Spark型Tecan酶标仪（上海帝肯贸易有限公司）。

试药：1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，批号为D141336）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS，批号为P112193）、无水柠檬酸（批号为H1827027）、铁氰化钾（批号为I1814108）、对氨基苯磺酸（批号为E1929192）、4 - 硝基苯基-β-D- 吡喃葡萄糖苷（pNPG，批号为D1717029）、没食子酸（批号为K1805015）、芦丁（批号为L2010248），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸二氢钠（批号为20190301）、可溶性淀粉（批号为20180501），均购自天津市大茂化学试剂厂；十二水磷酸氢二钠（西陇科学股份有限公司，批号为2110141）；3，5 - 二硝基水杨酸（DNS，国药集团化学试剂有限公司，批号为20170904）；α- 淀粉酶（批号为SLCF5282）、α - 葡萄糖苷酶（批号为SLCG0041），均购自美国Sigma 公司；牛血清蛋白（上海百研生物科技有限公司，批号为WXBC2003V）；维生素C（VitC，批 号 为C10701117）、福 林 酚（批 号 为C10496226）、硝酸铝（批号为C10373927），均购自上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为分析纯。钝药野木瓜果实于2020 年10 月采自广东省梅州市平远县，经嘉应学院医学院张声源副教授鉴定为正品。

1.2 方法

1.2.1 醇提物制备

取样品果实，将其果皮、果肉、种子晒干，粉碎，按料液比1∶2（g/mL）分别加入95%乙醇浸泡12 h，40 ℃超声（功率200 W，频率40 kHz）提取40 min，滤过，重复3次，合并滤液后减压浓缩，得到种子、果肉、果皮乙醇提取物分别为65.11，16.40，23.60 g，于5 ℃贮存，备用。

1.2.2 总酚、总黄酮含量测定

以没食子酸为对照品，采用福林酚法测定总酚含量［10-11］。以没食子酸当量（每1 g 样品中酚类化合物的没食子酸当量mg GA/g）为横坐标、吸光度为纵坐标进行线性回归。以芦丁为对照品，采用硝酸铝法测定总黄酮含量［12-13］。以芦丁当量（每1 g 样品中黄酮类化合物的芦丁当量mg RT/g）为横坐标、吸光度为纵坐标进行线性回归。

1.2.3 抗氧化活性测定

DPPH 法：取3 种醇提物各适量，分别制成醇提液。各取1.0 mL及VitC溶液（阳性对照，下同）1 mL，分别加入1.0 mL 0.1 mmol/ L DPPH 无水乙醇溶液，置于暗处，室温下反应20 min，分别计算醇提液和VitC 溶液对DPPH自由基的清除率［14-15］。

ABTS 法：精密移取不同质量浓度的醇提液及VitC溶液各100µL，ABTS+溶液3.9 mL，置同一试管中，室温放置10 min，以100 µL 无水乙醇和3.9 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）的混合溶液调零，分别计算醇提液及VitC 溶液对ABTS+的清除率［16-17］。

铁还原能力法：分别精密移取2.5 mL 的PBS 和K3Fe（CN）6溶液于10 mL 试管中，摇匀，50 ℃恒温水浴反应20 min，急速冷却，加入2.5 mL 三氯乙酸溶液，摇匀，6 000 r/ min 离心10 min，取上清液2.5 mL 于试管中，依次加入2.0 mL 蒸馏水与0.5 mL FeCl3溶液混匀，于700 nm 波长处测定吸光度（Ai）。以与待测溶液等量的无水乙醇为对照，以与K3Fe（CN）6溶液、三氯乙酸溶液和FeCl3溶液等量的蒸馏水为空白，同法测定对照的吸光度（A0）和空白的吸光度（Aj）。以VitC 的质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标进行线性回归，以3 种醇提液的吸光度与VitC相比，计算铁还原能力［18-19］。

1.2.4 降血糖活性测定

α-葡萄糖苷酶活性：取0.067 mol/L PBS 110µL、醇提液10µL、α-葡萄糖苷酶溶液（1 U/mL）20µL，混匀，37 ℃孵育15 min，加入4.0 mmol/L pNPG 20µL，混匀，37 ℃反应15 min，加入0.2 mol/L无水碳酸钠80µL终止反应，混匀，测定吸光度，并分别计算醇提液及阿卡波糖溶液（阳性对照，下同）对酶活性的抑制率［20-21］。

α-淀粉酶活性：制备系列质量浓度的3 种醇提液和阿卡波糖溶液，分别加入120µLα-淀粉酶溶液，混合，37 ℃孵育5 min，取出，加入1%淀粉底物缓冲液120 µL，混匀，37 ℃反应15 min，取出后加DNS 溶液200µL，置沸水浴5 min，取出，冷却至室温，加入1 040µL PBS；测定吸光度，并分别计算醇提液和阿卡波糖溶液对酶活性的抑制率［21-22］。

1.3 数据处理

采用Origin 8.5 软件分析，结果以X±s表示；采用SPSS 25.0 统计学软件进行单因素差异显著性分析和Pearson相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总酚、总黄酮含量

没食子酸回归方程为Y1= 95.577X1+ 0.032 1（r=0.996 5）、芦丁回归方程为Y2=12.823X2-0.003 2（r=0.999 4）。结果表明，没食子酸、芦丁分别在2.00～10.00 µg/ mL、8.00～72.00 µg/ mL 质量浓度范围内与相应吸光度线性关系良好。结果果肉的总酚含量（6.40 mg GA/ g）最高，其次为果皮（4.40 mg GA/ g），最低为种子（0.04 mg GA/g）。果皮的总黄酮含量最高（6.84 mg RT/g），其次为果肉（2.14 mg RT/g），最低为种子（0.28 mg RT/g）。

2.2 体外抗氧化活性

DPPH 自由基清除能力：DPPH 自由基的清除能力见图1。3 种醇提液对DPPH 自由基均有一定清除能力，且种子在0.62～20.00 mg/ mL，果皮和果肉在0.16～20.00 mg/ mL 范围内，清除能力随质量浓度的增加而增强。对DPPH 自由基清除能力，VitC［半数抑制浓度（IC50）=（0.007 ± 0.000 01）mg/ mL］＞果皮［IC50=（0.586 ± 0.016）mg/ mL］＞果 肉［IC50=（1.177 ±0.029）mg/mL］＞种子［IC50=（4.603±0.281）mg/mL］；且两两之间差异显著（P＜0.05）。

图1 DPPH自由基清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging ability

ABTS 自由基清除能力：ABTS 自由基清除能力见图2。3 种醇提液对ABTS 自由基均有一定清除能力，且种子在2.34～75.00 mg/ mL，果皮和果肉在0.59～75.00 mg/mL 范围内清除能力随质量浓度的增加而增强。ABTS 自由基清除能力大小为，VitC［IC50=（0.023±0.000 47）mg/mL］＞果皮［IC50=（2.850±0.08）mg/mL］＞果肉［IC50=（3.403 ± 0.11）mg/ mL］＞种子［IC50=（15.984 ± 0.19）mg/ mL］；且 两 两 之 间 差 异 显 著（P＜0.05）。

图2 ABTS+清除能力Fig.2 ABTS+ radical scavenging ability

铁还原能力：VitC 回归方程为Y= 14.109X+0.488 3（R2= 0.993 2），同法得3 种醇提液的回归方程。结果见图3。果肉的铁还原能力为（164.530 ±3.78）µmol VitC/g，显著强于果皮的（147.330±1.51）µmol VitC/g和种子的（75.010±3.73）µmol VitC/g（P ＜0.05）；且单因素方差分析和Duncan法分析显示，果皮、果肉及种子与VitC的铁还原能力存在显著差异（P ＜0.05）。

图3 铁还原能力Fig.3 Iron reduction ability

总酚、总黄酮含量与抗氧化能力的相关性分析：结果见表1。果肉、种子中的总酚、总黄酮含量与清除ABTS+、DPPH 自由基能力及铁还原能力均呈极显著正相关（P ＜0.01）；果皮的总酚、总黄酮含量与清除ABTS+能力呈极显著正相关（P ＜0.01）。

表1 抗氧化活性与总酚、总黄酮含量的相关性考察Tab.1 Correlation between the antioxidant activity and the content of total phenols and flavonoids

2.3 降血糖活性

抑制α-葡萄糖苷酶活性：3 种醇提液及阿卡波糖溶液对α- 葡萄糖苷酶活性的抑制率见图4。3 种醇提液对α- 葡萄糖苷酶活性均具一定抑制作用，且在3.12～200.00 mg/mL范围内时抑制率均随质量浓度的增加而升高。当果肉质量浓度大于50 mg/mL 时，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用趋于饱和。对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用大小为，阿卡波糖［IC50=（3.08±0.27）mg/mL］＞果肉［IC50=（15.85±0.70）mg/mL］＞果皮［IC50=（30.16 ± 1.30）mg/ mL］＞种子［IC50=（119.89 ± 0.98）mg/ mL］；且 两 两 之 间 差 异 显 著（P＜0.05）。

图4 α-葡萄糖苷酶活性抑制率Fig.4 Inhibitory rate of α-glucosidase activity

抑制α- 淀粉酶活性：3 种醇提液及阿卡波糖溶液对α-淀粉酶活性的抑制率见图5。3 种醇提液对α-淀粉酶活性均具一定抑制作用，且种子、果皮在6.25～200.00 mg / mL，果肉在15.00～45.00 mg / mL 范围内抑制率随质量浓度的增加而升高。当质量浓度小于30 mg/mL 时，果肉对α-淀粉酶活性的抑制作用小于阿卡波糖，当超过30 mg/ mL 时前者抑制作用大于后者。对α- 淀粉酶活性抑制作用的大小为，阿卡波糖［IC50=（0.34±0.016）mg/mL］＞果肉［IC50=（20.35±0.021）mg/mL］＞果皮［IC50=（37.11±1.12）mg/mL］；且两两之间差异显著（P＜0.05）。种子未测出。

图5 α-淀粉酶活性抑制率Fig.5 Inhibitory rate of α-amylase activity

3 讨论

3.1 抗氧化活性

崔霖芸［12］对野木瓜的抗氧化研究发现，醇提物中总黄酮含量及抗氧化活性均强于水提物，黄酮是野木瓜抗氧化活性的物质基础。由此可知，醇溶剂能有效提取野木瓜的抗氧化有效成分。本研究结果表明，果皮、果肉及种子对DPPH 自由基及ABTS+清除能力的强弱顺序一致，均为果皮＞果肉＞种子，而铁还原力法的强弱顺序却为果肉＞果皮＞种子，其原因可能为，3 种评价方法的作用机制不同［23］，DPPH 法和ABTS 法是基于自由基机制，铁还原力法基于铁离子的价态改变反映抗氧化能力；种子、果皮及果肉中的抗氧化有效成分和含量不同，如本研究中发现3 个部位的总酚、总黄酮含量及其与不同抗氧化方法的相关性不一致。结果显示，总黄酮与总酚是钝药野木瓜发挥抗氧化活性的物质基础，该结果丰富了钝药野木瓜食用药用的科学内涵。

3.2 降血糖活性

陈瑛等［24］研究发现，野木瓜具有良好的降血糖作用。本研究结果表明，果皮、果肉对α- 葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性均有明显的抑制作用，其中果肉的抑制能力最强，表明果肉中富含降血糖活性成分，后续可对其活性成分进行富集和分离纯化，以评估其单体化合物的降血糖能力。

钝药野木瓜果实中的果皮、果肉具有良好的抗氧化及降血糖作用，后续可研究测定果皮、果肉不同溶剂提取物的总酚、总黄酮含量并进一步对提取物中的总酚、总黄酮分离纯化，明确活性物质基础；也可对果肉中的降血糖活性成分进行富集和分离纯化，评估其单体化合物的降血糖能力，以分析构效关系，阐明其药用科学内涵。

综上所述，钝药野木瓜果实具有开发成降血糖、抗肿瘤等功效保健食品或药品的潜力，本研究结果可为其在食药领域的综合开发利用提供依据。