基于微小RNA-142-3p 与细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4 的 相互作用探讨细胞因子在原因不明反复性流产的作用

刘细红，李 丽，谭素萍，张金瑞，李辉珍，李 琪

[中国科学院大学深圳医院（光明）妇科，广东 深圳 518107]

原因不明反复性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）是指女性与同一性伴侣连续两次及以上发生自然流产，且与染色体、解剖结构、内分泌、自身免疫异常和生殖道疾病等因素无关，是临床上育龄女性常见的妊娠疾病之一[1]。目前在临床上URSA 仍属难治性不孕症，给男女双方造成极大的痛苦，已成为国内外专家共同关注的医学难题。近期，生殖免疫学观点认为，正常胚胎不被母体排斥有赖于母胎界面的免疫耐受，而一旦这种格局被打破将导致URSA 的发生[2]。研究发现，在体内抑制细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）可以解除调节性T 细胞（Treg）介导的移植排斥反应的保护作用，表明CTLA-4 的表达可调节Treg 细胞的功能[3]。另外，微小RNA-142-3p（miR-142-3p）是一种长19～24 核苷酸的短链非编码小RNA，调控树突状细胞及巨噬细胞功能，并与T 细胞异常激活、维持Treg 细胞稳态及免疫抑制功能有关[4]。因此，本研究通过结合临床样本，探究免疫功能失调与URSA 的发病机制相关性，并初步探讨其发病的潜在机制，为临床预防与治疗提供理论参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2016 年9 月至2017 年12 月中国科学院大学深圳医院（光明）收治的45 例URSA 患者纳入流产组，另选取同期于中国科学院大学深圳医院（光明）进行检查的40 例健康早孕者作为对照组进行回顾性研究。流产组研究对象年龄24～36 岁，平均年龄（29.15±4.29）岁；身高158.39～170.21 cm，平均身高（166.14±5.24）cm；体质量45.83～70.51 kg，平均体质量（64.82±5.76）kg；身体质量指数（BMI）18～25 kg/m2，平均BMI（23.54±2.40）kg/m2；腰围57.38～78.51 cm，平均腰围（63.02±1.77）cm；臀围84.27～108.73 cm，平均臀围（92.43±4.24）cm；腰臀比0.55～0.73，平均腰臀比0.68±0.04。对照组研究对象年龄23～37 岁，平均年龄（28.28±4.75）岁；身高157.46～168.46 cm，平均身高（165.79±8.06）cm；体质量45.27～70.88 kg，平均体质量（62.9±6.61）kg；BMI 18～25 kg/m2，平均BMI（23.04±3.35）kg/m2；腰围55.86～76.33 cm，平均腰围（63.4±1.69）cm；臀围82.75～105.41 cm，平均臀围（92.74±4.37）cm；腰臀比0.57～0.76，平均腰臀比0.69±0.04。本研究经中国科学院大学深圳医院（光明）医学伦理委员会批准。流产组产妇纳入标准：①符合《复发性流产诊治的专家共识》[5]中原因不明反复性流产的诊断标准；②流产在妊娠3 个月内；③自然流产2 次以上；④患者双方无遗传性疾病；⑤内分泌正常、无代谢性疾病；⑥封闭抗体、血小板聚集等生化检测正常；⑦无过敏史。排除标准：①有分泌系统疾病者；②有梅毒等病原微生物生殖道感染者；③临床诊断资料缺失者；④患者出现明显病情变化。对照组产妇纳入标准：①未经任何临床治疗的自然妊娠孕妇；②封闭抗体、血小板聚集、血常规、肝功能等生化检测正常。排除标准：①合并脏器疾病、生殖道感染、生殖道畸形者；②临床诊断资料缺失者；③研究对象出现明显病情变化。

1.2 检测方法

1.2.1 一般临床指标检测 在流产组治疗期间及对照组产检期间，通过询问、测量等手段，对人口学相关资料进行记录登记。

1.2.2 流式细胞术检测外周血CD4+CD25+Treg 细胞 分别采集研究对象清晨空腹静脉血于肝素抗凝管中，加入红细胞裂解液离心、PBS 缓冲液洗涤；严格按照说明书操作，对照管加入FITC 标记山羊抗兔IgG（FITC-IgG）和PE 标记小鼠抗山羊IgG（PE-IgG）；实验管加入FITC 标记小鼠抗人CD4（CD4-FITC）和PE 标记小鼠抗人CD25（CD25-PE）（美国R&D 公司），室温避光孵育后，离心（3 500 r/min 转速，时间10 min），取上清液；加入细胞染色缓冲液，采用流式细胞仪（美国BD 公司，型号：BD Accuri C6）检测。

1.2.3 酶联免疫吸附法（ELISA）检测Th1/Th2 型细胞因子 抽取研究对象外周静脉血，离心取上清液。检测γ 干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）水平，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作。使用多功能酶标仪（美国Bio-Tek 公司，型号：Synergy H1）测定各孔的吸光值，进一步推断计算各个标本中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 的浓度。

1.2.4 荧光素酶检测 培养293T 细胞，取质粒2 µg，野生型（Wild type，WT）/突变型（Mutant type，Mut）psi CHECK2报告载体：miR-142-3p 拟似物（miR-142-3p minic）/miR-142-3p 抑制剂（miR-142-3p inhibitor）=1∶1，与0.5 mL 减血清培养基（opti-MEM）混匀；取5 µL 脂质体200 转染试剂与0.5 mL opti-MEM 混匀；将质粒混合物与转染试剂混合物混匀，静置。将上述混合物均匀滴加到标记好的六孔板中，恒温培养。将培养基吸除，加裂解缓冲液裂解细胞，移入96 孔板；加荧光素酶测定试剂Ⅱ检测荧光值。BLAST 生信分析，在Targetscan 官方网站上（https://www.targetscan.org/vert_80/）基因名称输入CTLA-4，microRNA 名称内输入miR-142-3p，点击提交。检索到603 个保守位点的转录本，搜索到对应CTLA-4 对应的信息，找到miR-142-3p 与CTLA-4 潜在结合的信息。

1.3 观察指标①分析两组研究对象外周血中CD4+CD25+Treg 细胞百分比。②分析两组研究对象外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 细胞因子水平。③分析miR-142-3p 与CTLA-4 的相互作用。④通过BLAST 生信分析检索结果，找到CTLA-4 转录本，明确miR-142-3p与CTLA-4 结合具体信息。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0 统计学软件处理数据。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t法或S-N-K 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 比较两组研究对象外周血中CD4+CD25+Treg 细胞百分比流产组研究对象外周血中CD4+CD25+Treg 细胞百分比[（4.06±1.53）%]显著低于对照组[（7.95±1.13）%]，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、图2、图3。

图1 对照组研究对象CD4+CD25+Treg 细胞流式细胞仪检测图

图2 流产组研究对象CD4+CD25+Treg 细胞流式细胞仪检测图

图3 两组研究对象CD4+CD25+Treg 细胞百分比比较

2.2 两组研究对象外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 水平比较流产组研究对象外周血中IL-10 和IL-4 的表达水平低于对照组，而IL-2 和IFN-γ 的表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；同时，流产组研究对象的IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4 比值分别为（0.96±0.19）和（0.89±0.21），高于对照组（0.43±0.18、0.41±0.15），差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组研究对象外周血IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 水平比较（pg/mL，x）

2.3 miR-142-3 与CTLA-4 相互作用检测通过BLAST生信分析，明确miR-142-3p 与CTLA-4 潜在的结合位点，发现两者有较好的结合能力。同时，进一步通过荧光素酶报告基因检测，结果显示miR-142-3p 与CTLA-4 有较强的结合能力，表明miR-142-3p 对CTLA-4 的表达具有潜在的抑制作用，见图4。

图4 miR-142-3p 与CTLA-4 结合位点和结合能力分析

3 讨论

近年来，随着机体免疫学研究的不断深入，发现URSA与异常的母体系统免疫反应有关，其具体的发病机制尚待进一步研究[6-7]。有研究显示，与正常未孕妇女及URSA 患者相比，正常早孕妇女外周血CD4+CD25+Treg 细胞水平显著升高，表明CD4+CD25+Treg 细胞在维持正常妊娠中扮演重要角色，可能对母胎免疫耐受具有调节作用[8]。研究表明，CD4+CD25+Treg 细胞在细胞免疫功能中发挥极其重要的作用[9]。在器官移植的免疫排斥反应中，CD4+CD25+Treg细胞数量减少，CD4+CD25+T 细胞被激活产生细胞毒性，引起免疫损伤，并协助B 细胞参与抗原-抗体联合反应。在T 细胞受体激活后，Tregs 可抑制CD4+和CD8+T 淋巴细胞细胞中IL-2 基因的转录和表达，以抑制T 细胞的增殖和激活，从而调节免疫耐受[10]。本研究发现，流产组研究对象外周血CD4+CD25+Treg 细胞显著高于对照组，与上述研究结果类似。另外，与正常妊娠组相比，URSA 患者体内Th1 型细胞因子呈递增趋势，而Th2 型细胞因子呈下降趋势，从而导致流产发生，故调节Th1/Th2 的平衡有助于降低URSA 的发生率[11]。本研究结果显示，URSA 患者的外周血细胞因子IL-10 和IL-4 的表达水平均显著低于对照组，而细胞因子IL-2 和IFN-γ 的表达水平高于对照组。

CTLA-4 已被证明是T 细胞功能的负调控因子，参与Th1/Th2 细胞的发育和Treg 细胞的功能，在维持免疫系统内稳态方面的关键作用[12]。研究显示，抗CTLA-4 抗体可增强Th1 型免疫和抑制Treg 细胞活性[13]。同时，许多微小RNA（miRNA）在多种病理病例中直接或间接调节CTLA-4和程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1（PD-1/PD-L1）的表达[14]。

综上所述，miR-142-3p 与CTLA-4 具有较强的结合能力，表明miR-142-3p 对CTLA-4P 的表达具有潜在的抑制作用，这可能是导致URSA 发生的可能机制之一。