斑马鱼用于医学实验教学的可行性分析与探讨*

刘延英 陈文静 龙腾腾 崔 晴 张志刚 高 垚 初文昌 赵靖文 单筠睿 梁美英 岳 旺

青岛黄海学院基础医学教研室，山东省青岛市 266427

医学实验教学是促进医学生基础医学理论知识与实践相结合，开发医学生学习潜力、启发创新性思维，提高未来临床实践能力，培养复合型医学人才的一门重要学科，是医学生学习过程中不可缺少的一部分。传统的医学实验教学，例如医学机能学实验，多采用哺乳类动物如小鼠、大鼠、家兔或狗等为动物模型来完成教学。但是，这些模式生物本身都存在缺陷包括动物价格昂贵、饲养周期长、动物具有攻击性、操作复杂和实验结果重复性差等方面的问题。因此，寻找一种安全可靠、简单经济易操作的理想模式生物代替传统的哺乳动物完成实验教学，已成为医学实验教学研究中的一项重要内容。

斑马鱼是一种原产于南亚，印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地的热带淡水硬骨鱼。在20世纪70 年代, 美国俄勒冈大学著名遗传学家 George Streisinger的研究小组对斑马鱼进行了系统的研究，为斑马鱼成为一种模式生物奠定了基础。在随后的几十年中，斑马鱼因为其本身独特的生理解剖结构特点和作为模式生物不同于其他动物的优势被广泛用于遗传发育生物学[1-2]、人类疾病[3-4]、环境毒理学[5]和药理学[6-7]等领域的研究。在医学实验教学中，斑马鱼能否发挥其独特优势，替代部分传统的哺乳动物完成实验教学是一个值得探讨的问题。本研究采用医学机能学实验教学经典的药理学实验中的呼吸兴奋剂尼可刹米(Nikethamide)分别处理斑马鱼和小鼠，观察溶于水中的尼可刹米对斑马鱼游泳行为的影响和致惊厥量的尼可刹米导致小鼠惊厥反应表现，探讨和分析斑马鱼作为医学教学用实验动物的潜在价值和可行性。

1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器和药品 成年斑马鱼(购自山东一溪月生物科技有限公司)，雌雄不限，体长(35±5)mm，体重(180±50)mg，于水族箱中饲养，昼夜自然照明。室温与水温控制在(24±3)℃，水质接近中性，pH值保持在6.5～7.5，每3～4d换水1次。正常喂食，2次/d。适应性驯养5d后，取斑马鱼30条，禁食12h后用于实验。

成年雄性昆明种小鼠20只(由青岛市实验动物中心提供)，体重(23±5)g。室温控制在(22±3)℃，昼夜自然照明。正常饮食，适应性饲养1 周，于实验前禁食12h。

圆柱形水族箱，直径20cm，高15cm，市场购得；灭菌注射用水(500ml/瓶，陕西圣奥动物药业有限公司)；无菌生理盐水(100ml/瓶，山东科伦药业股份有限公司);1ml无菌注射器(潍坊市华星医疗器械有限公司)；电子天平(JA2003,上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；玻璃烧杯(50～100ml)和量筒(Bomex,50ml,北京博美玻璃有限公司)；尼可刹米(1.5ml,0.375g/支，天津金耀药业有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 测试尼可刹米对斑马鱼的作用：将用于实验的30条斑马鱼被随机分为对照组、低剂量组和高剂量组，每组10条。以无菌注射用水配制不同浓度的尼可刹米。低剂量组的配制比例(体积比)是无菌注射用水∶尼可刹米=250∶1，尼可刹米最终浓度为1mg/ml；高剂量组的配制比例(体积比)是无菌注射用水∶尼可刹米=66.67∶1，尼可刹米最终浓度为3.75mg/ml；对照组斑马鱼的测试水中仅加入无菌注射用水。主要操作步骤：首先取100ml量筒，将无菌注射用水和尼可刹米按照上述不同的比例进行混匀，其次将配制好的不同浓度的尼可刹米分别倒入洁净的100ml烧杯中，静置2～3min，然后将各组斑马鱼依次投放入水，最后观察斑马鱼在水中游泳的状态，记录鱼的主要游泳行为改变及死亡情况。

1.2.2 检测尼可刹米对小鼠的致惊厥作用：将用于实验的20只昆明小鼠被随机分成对照组和实验组，每组10只。小鼠被抓取固定后，腹部向上，腹部皮肤经75%酒精消毒后，用1ml注射器进行腹腔注射。实验组的小鼠注射300mg/kg尼可刹米；对照组的小鼠腹腔注射等体积的无菌生理盐水。观察尼可刹米对小鼠的作用，观察时间为10min，记录小鼠的反应、兴奋惊厥发生时间和死亡时间。

2 结果

2.1 尼可刹米导致斑马鱼兴奋惊厥 将斑马鱼投入含有不同浓度尼可刹米的水中，观察斑马鱼游泳行为的改变。实验结果如表1所示，溶于水中的尼可刹米可以引起斑马鱼不同程度的兴奋。与对照组相比，低剂量组(1.0mg/ml)，斑马鱼表现为轻度兴奋状态，仅出现游泳速度加快，偶尔有头部撞击烧杯壁，摆尾幅度加大，除一条斑马鱼出现侧翻和死亡外，其余的斑马鱼均能存活。高剂量(3.75mg/ml)尼可刹米处理组的斑马鱼，与对照组相比，则表现极强的兴奋作用(见表1和图1)。在高浓度的尼克刹米作用下，斑马鱼最初表现为快速游动，头部连续撞击烧杯壁，身体扭曲，剧烈摆尾、蹿跳等表现，几分钟后出现身体侧翻，打转、腹部向上飘浮，随后出现游动弛缓。飘浮一段时间后，斑马鱼可重复出现持续2～3s快速游动后，又迅速发生身体侧翻、腹部向上的悬浮漂游状态，最后呼吸停止，死亡。

表1 尼克刹米对斑马鱼游泳行为的影响(n=10)

图1 尼可刹米引起斑马鱼兴奋惊厥

1：斑马鱼兴奋：斑马鱼游泳速度加快、头部撞击烧杯壁、摆尾幅度增加(a)，继而变为上下乱窜、极度兴奋(b)；2：游动弛缓：斑马鱼由极度兴奋状态转为游动弛缓，游泳速度变慢、身体侧翻、腹部向上，呼吸急促(c)；3：死亡：斑马鱼重复几次短暂快速游动、侧翻飘浮后、呼吸停止，死亡(d)

2.2 尼可刹米诱导小鼠惊厥反应 对照组和实验组小鼠分别经腹腔注射生理盐水或致惊厥量的尼可刹米后，对照组小鼠表现为正常活动，无异常表现。实验组小鼠在注射尼可刹米约0.5min出现倒退、竖尾、转圈等兴奋表现，大约1min，小鼠表现为上蹿下跳，全身剧烈抽搐、痉挛、肢体伸直、艰难贴壁走，部分小鼠出现口吐鲜血、随后倒地、呼吸困难、大小便失禁。大部分小鼠在6.5min左右死亡(见表2)，仅有1只小鼠存活时间超过10min，然后死亡。

表2 尼克刹米对小鼠的致惊厥作用(n=10)

3 讨论

医学实验的开展推动着医学的进步，对现代医学科学的建立和发展起决定性作用。医学机能实验学是通过融合生理学、病理生理学、药理学的实验技术和方法，研究生物体的正常生理机能、疾病的发病机制和药物相互作用规律的一门科学。它是医学生对基础医学理论知识掌握和理解的主要途径，是促进理论与实践相结合，培养合格医学生的基础。在医学机能学教学实验中，大部分实验包括部分在体动物实验，离体器官、组织功能研究，电生理实验和病理模型的制备等方面的教学是通过实验动物来完成。它是将抽象的理论形象化、具体化和客观化，帮助学生对所学基础理论知识的进一步理解和巩固；在验证经典理论的同时，为学生提供开发创新性思维的空间和平台。因此，实验设计科学合理、操作简便、实验结果可靠和实验的趣味性等因素均影响实验教学的质量。为了提高教学质量，尽管在教学方法上不断改进，例如不同的新教学方法包括基于问题的学习(Problem-based learning，PBL)教学方法[8]和对通过内在动机和学习注意力优化绩效(Optimizing Performance Through Intrinsic Motivation and Attention for Learning, OPTIMAL)理论[9]的研究已被应用于医学实验教学中，在一定程度上提高了医学实验教学的教学质量，但是，实验动物是医学实验教学的不可或缺的部分，实验动物的选择对高质量完成医学实验教学具有重要的意义。因此，选择合适的模式生物也是医学实验教学的重要研究内容之一。

斑马鱼是一种与人类基因相似度达87%的模式生物。它属于脊椎动物，与其他脊椎动物(如小鼠、大鼠) 相比，斑马鱼具有体积小、价格低廉、易饲养、对水质和环境的要求不高、繁殖及生长速度快、生命周期短、实验费用低、操作简单、对操作者无潜在的攻击危险和实验结果重复性好等优点。它已成为医学与生命科学研究领域的一种重要模式生物[10-12]。因为斑马鱼对水环境的变化反应十分敏感，当水中的药物或毒物达到一定浓度时，斑马鱼就会产生一系列反应,包括鱼的行为改变、生理功能异常、组织细胞变性直至死亡，所以在古代，鱼类毒性试验是常用作检测水体污染的有效方法之一。随着现代科学技术的进步，斑马鱼已被广泛用于水源、空气、食品和环境等毒理的研究中[13]。中国对斑马鱼的研究始于20世纪90年代，真正被世界认可的是21世纪后的研究成果[14]，包括在胚胎发育、造血系统及相关疾病的调控及其他系统疾病和生态毒理学方面的研究推动了中国现代科技的进步[15-16]。

在高校医学机能学教学实验中，药物毒性测定是药理学必修实验内容。该实验多选用的哺乳动物包括小鼠、大鼠、家兔等，但是这些哺乳类动物存在实验周期长、用药剂量大、饲养成本及费用高、操作复杂和潜在动物攻击危险等问题及动物福利的实施和伦理学冲突等现实矛盾。因此，在医学实验教学中，有必要寻找一种像斑马鱼这样成本低廉、操作简单、测试周期较短、重复性好的模式生物来代替传统哺乳动物，完成药物毒性检测和评价的实验。

尼可刹米是一种作用机理明确的临床常用呼吸兴奋剂，剂量过大可导致惊厥。本研究中，分别测定斑马鱼对不同浓度尼可刹米的反应，并与惊厥量的尼可刹米导致小鼠惊厥反应的结果比较。实验结果证明尼可刹米溶于水中可改变斑马鱼的游泳行为，引起斑马鱼的兴奋惊厥；此种惊厥反应与高剂量的尼可刹米导致小鼠惊厥反应基本相似。这些研究结果证明斑马鱼已经具备成为医学实验教学用实验动物的基本条件。将来在医学实验教学中，有替代哺乳类动物完成教学实验的可行性。斑马鱼在教学中的应用，除了用于验证经典的医学基础实验，加深学生对医学知识理论的理解外，它还可推广到综合性实验和创新性实验层次，例如斑马鱼体积小，易携带，为研发便携式毒性检测装置奠定了基础。总之，在未来医学教学实验中，斑马鱼模式生物的应用将增加基础医学实验课的趣味性，防止学生面对哺乳动物时恐惧心理的产生，激发其学习兴趣和热情，提高教学质量，适合用于医学生部分医学机能实验课程的开发和推广，为实验教学改革提供了新思路。