天麻洋参含片中天麻素和人参总皂苷的含量测定

◎杨 芳，龙泽霞，卢文艳，刘 颖，朱军君

（1.常德市食品检验所，湖南 常德 415000；2.湖南德海制药有限公司，湖南 常德 415000）

天麻洋参含片是一种保健食品，主要成分为天麻、西洋参等，经粉碎、灭菌、混合、制粒、干燥、压片等工序制成片剂。按《保健食品检验与评价技术规范》开展功能学评价表明，天麻洋参含片具有明显的延缓衰老功能[1-2]。目前保健食品相关的技术规范尚未制定天麻素及人参总皂苷含量测定方法，为提高产品的质量控制水平，确保产品质量的一致性。本文参照中国药典及其他文献[3-6]的方法测定，对天麻洋参含片的主要活性成分天麻素及人参总皂苷进行研究，分别建立了高效液相色谱法测定天麻洋参含片中天麻素含量和紫外-可见分光光度法天麻洋参含片中人参总皂苷含量。

1 实验材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 试样

天麻洋参含片（批号：20200909、20200915、20201022）、阴性试样（包括不含天麻阴性试样、不含西洋参阴性试样）均由湖南德海制药有限公司生产。

1.1.2 标准品

天麻素（中国食品药品检定研究院，批号：110807-202010，含量：95.5%）；人参皂苷Re（中国食品药品检定研究院，批号：110754-201826，含量：97.4%）。

1.1.3 试剂

水为一级水；乙腈：色谱纯，除非另有说明，本方法使用试剂均为分析纯（如:无水乙醇、氯仿、磷酸、高氯酸、香草醛、冰乙酸、乙醇等）。

1.2 仪器

高效液相色谱仪配DAD 检测器（安捷伦，1260型）、色谱柱（ULtimate AQ-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）、双光束紫外-可见分光光度计（北京普析，UV-1900）、分析天平（精度为0.000 1 g）、KQ2200E型超声波发生器、超纯水仪、涡旋振荡器。

2 方法与结果

2.1 天麻素的含量测定

2.1.1 实验溶液的制备方法

（1）标准溶液的制备。精密称定天麻素10.0mg（精度0.000 1 g），于50 mL 容量瓶中，加流动相溶解稀释至刻度，混匀，即得0.191 mg/mL天麻素标准溶液[6-7]。

（2）试样溶液的制备。取本品20 片，于研钵中研成细粉，精密称定细粉1.0 g（精度0.000 1 g）试样置于具塞锥形瓶中，加甲醇15 mL，涡旋混匀，超声处理30 min，静置30 min[8]，将甲醇液转移至30 mL容量瓶中，于残渣中加甲醇15 mL，涡旋混匀，超声处理30 min，静置30 min[8]，将甲醇液转移至30 mL 容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，混匀，过滤，取上清液5 mL，蒸干，加流动相溶解并转移至10 mL 容量瓶中，并用流动相定容至刻度，混匀，即得试样溶液，取适量上清液过0.22 μm 滤膜，待液相色谱测定。

（3）不含天麻阴性试样溶液的制备。取天麻阴性试样，按步骤（2）试样溶液配制方法制成不含天麻阴性试样溶液。

2.1.2 仪器参考条件

色谱柱：C18柱；以甲醇-磷酸盐缓冲液（0.1 moL/L 的磷酸二氢钾溶液和0.1 moL/L 的磷酸二氢钠溶液等量混合）一水（3.0：4.5：92.5）为流动相；流速为1.0 mL/min；检测波长为220 nm；柱温为35 ℃；进样量是10 μL。

（1）检测波长确定。取天麻素标准溶液，在DAD检测器下扫描，结果天麻素标准溶液在219.61 nm 处有最大吸收[10]，故将220 nm 定位本品的检测波长，具体如图1 所示。

图1 DAD 检测器波长扫描图

（2）流动相确定。分别选用了乙腈与0.05%磷酸，甲醇与0.05%磷酸等不同比例的流动相试验，但均不能达到满意效果，采用甲醇-磷酸盐缓冲液（0.1 moL/L 的磷酸二氢钾溶液和0.1 moL/L 的磷酸二氢钠溶液等量混合）一水（3.0 ∶4.5 ∶92.5）为流动相后，天麻素与相邻色谱峰分离度符合要求，阴性无干扰。色谱图如图2～图4 所示。

图2 标准溶液的色谱图

图3 试样溶液的色谱图

图4 不含天麻素的阴性试样溶液色谱图

2.1.3 方法验证

（1）提取条件的考察实验。取本品20 片，于研钵中研成细粉，精密称取细粉1.0 g（精确至0.000 1 g），于具塞锥形瓶中，考察不同体积的甲醇用量（15 mL、20 mL、30 mL、40 mL）、超声时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）等，以考察提取效率，结果：加甲醇15 mL[9]，涡旋混匀，超声处理30 min，静置30 min 后再重复1 次，试样溶液色谱图中天麻素峰面积稳定，故选择甲醇15 mL，涡旋混匀，超声处理30 min，静置30 min[8]将甲醇液转移至30 mL 容量瓶中，于残渣中加甲醇15 mL，涡旋混匀，超声处理30 min。

（2）线性范围考察。液相色谱法的自动进样器精密吸取2.1.1 项中标准溶液1 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL 注 入 高效液相色谱仪，按2.1.2 节仪器参考条件测定。根据标准溶液的峰面积与进样量，计算线性回归方程。结果：线性回归方程为Y=655 428X-651 265，R2=0.999 7，天麻素在0.191～5.73μg 的质量浓度范围内的线性关系良好。

（3）精密度实验考察。取2.1.1 节标准溶液10μL，注入高效液相色谱仪，按2.3.1 节仪器参考条件测定，连续6 次，记录天麻素色谱峰面积，计算6 次进样色谱图中天麻素峰面积RSD（n=6）为0.2%，该方法精密度良好。

（4）稳定性的考察实验。取2.1.1 节试样溶液，在室温放置0，4，8，12，24，48 h 后，按2.1.2 节仪器参考条件测定，记录天麻素峰面积，根据不同时间的天麻素峰面积，计算RSD 为0.6%（n=6），该方法试样溶液在48 h 内稳定性好。

（5）重复性的考察实验。取天麻洋参含片试样（批号：20200909），精密称取6 份，按2.1.1 节实验溶液的制备方法制备试样溶液，按2.1.2 节仪器参考条件测定峰面积，结果：记录天麻素色谱峰面积，其RSD为0.8%，试样天麻素的平均含量为 2.659 4 mg/g。本方法重复性好。

（6）准确度的考察实验。采用加样回收率法[15]，取已知含量的试样9 份（批号：20200909，2.66 mg/g），按50%、100%、150% 量分别加入天麻素标准品，按2.1.1 节实验溶液的制备方法配制低、中、高3 组浓度的试样溶液，每1 制备浓度2 份，按2.1.2 节仪器参考条件测定天麻素含量，计算回收率。结果：天麻素平均回收率为97.6%（n=9）。试验结果见表1。

表1 天麻素回收率测定结果表（n=9）

（7）限度确定。取天麻洋参含片试样3 批，按已确定的方法测定每批含量。结果，3 批试样天麻素平均含量为2.662 mg/g，相对偏差为1.5%。按3 批试样天麻素平均含量约70%含量确定本品天麻素含量为不低于1.8 mg/g。

2.2 人参总皂苷含量测定

2.2.1 实验溶液的制备方法

（1）试样溶液的制备方法。取本品适量，研细，取细粉1 g，精密称定，置100 mL 的容量瓶中，加适量水超声处理30 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，静置10 min，吸取上清液1.0 mL，加入已处理好的中性氧化铝与AmberLite-XAD-2 复合层析柱，分别用水、70%乙醇洗涤，收集70%乙醇洗涤液于蒸发皿中，60 ℃水浴挥干，加0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液使残渣溶解，再加入0.8 mL 高氯酸，转入5 mL 具塞刻度离心管中，60 ℃水浴上加热10 min，取出、放冷，准确加入冰乙酸5.0 mL，摇匀，即得。

（2）标准溶液的制备方法。精密称取人参皂昔Re 20 mg，置25 mL 容量瓶中[7]，加甲醇溶解并稀释至刻度，吸取100 μL 于蒸发皿中蒸干，按照2.2.1 节试样溶液配制60 ℃水浴蒸干后，相同方法操作，即得。

（3）不含西洋参阴性试样溶液的配制。除西洋参阴性试样，按2.2.1 节实验溶液的制备方法制成不含西洋参阴性试样溶液。

2.2.2 测定波长的选择实验

取上述标准溶液、试样溶液、阴性试样溶液，在190～800 nm 波长范围内进行紫外扫描。结果：560 nm 处，标准溶液、试样溶液均有一个明显的吸收峰，阴性试样溶液未见吸收峰，故选定560 nm 为试样的测定波长。

2.2.3 标准曲线的考察实验

精密吸取标准溶液20、40、60、80、100、150、200μL，置于蒸发皿中，60 ℃水浴挥干，照2.2.1 节试样溶液制备方法，在60 ℃水浴蒸干后同法操作，配制标准曲线溶液，按照紫外-可见分光光度法于560 nm 处测定吸光度，横坐标为标准溶液浓度，纵坐标为吸光度进行线性回归，计算标准曲线方程及其相关系数，线性回归方程为y=0.482 1x-0.059 2，R2=0.999 5。人参皂苷在0.191～5.73μg的质量浓度范围内的线性关系良好。

2.2.4 精密度的实验考察

取供试品6 份，每份1.0 g，按上述2.2.2（1）节所述方法处理，记录吸光度值，计算 RSD=0.82%，表明方法精密度良好。

2.2.5 准确度的实验考察

采用加样回收率法[15]，取已知含量的试样9 份（0.5 g），分别加入50%、100%、150%的人参总皂苷，按2.2.1 节处理，测定各试样的含量，计算回收率。结果：回收率在95.6%～98.2%，平均回收率为96.8%，RSD=0.9%。此方法的准确度高。（见表2）

表2 人参总皂苷准确度测定结果表（n=9）

2.2.6 限度制定

测定3 批天麻洋参含片试样，其均值为1.031 31 mg/g，按70% 含量计算，则本品每100 g含总皂苷不低于720 mg。

3 结论

天麻和西洋参均是药食同源品种。天麻中所含的天麻素是缓解疲劳的活性成分[10]。西洋参具有抗癌、抗缺氧和抗疲劳、抗糖尿病、镇静等多种药理作用[11]。人参皂苷是西洋参的主要活性成分和重要质量控制指标[12]，其含量是人参的很多倍，具有抗疲劳、抗肿瘤等多方面的药理活性[13]。天麻西洋参含片中天麻素和人参总皂苷含量的测定是保证产品质量、维护消费者合法权益的有效手段之一。

本文研究建立了适用于天麻洋参含片天麻素[14]含量测定的液相色谱法，该方法适用范围广、专属性强，适用于以人参总皂苷为标准品，利用紫外可见分光光度法测定其总皂苷含量[15-16]。结果表明：本文的研究方法具有简便、快速、重现性好等优点，是用于天麻素和总皂苷成分保健食品简单、及时、有效的监测方法，为其标准制定提供了科学参考，可以满足产品质量控制及市场监管的需求。