网络药理学结合巨噬细胞实验分析薏苡仁抗炎机制

刘杰 刘振强 包蕾

炎性反应是机体内一种重要且复杂的生物过程，它可以保护机体免受感染、损伤或损伤造成的潜在伤害。有效的炎性反应依赖于免疫系统、血管系统和组织之间细胞和分子复杂的相互作用[1]。但是当细胞和分子之间的稳态被打破，会引发过度的炎性反应，最终导致免疫介导的炎症性疾病，包括类风湿性关节炎、炎症性肠病、牙周炎、血管炎等多种疾病[2-4]。持续的慢性低水平炎性反应还会导致冠心病、代谢综合征、糖尿病肾病[5,6]，甚至炎症也越来越多地被认为是导致癌症和精神疾病的诱因[7]。因此，有效的降低过度炎性反应至关重要。薏苡仁为禾本科植物薏苡 Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen (Roman.) Stapf 的干燥成熟种仁。性甘、淡、凉，归脾、胃、肺经。化学成分包括脂肪油、薏苡仁酯、薏苡仁内酯、薏苡仁多糖等。主要应用于水肿、脚气浮肿、小便不利、脾虚泄泻、湿痹拘挛、肺痈、肠痈、赘疣等多种疾病[8]。目前，临床上关于薏苡仁治疗风湿病、皮肤病和肾病等炎症相关的疾病有很多报道，疗效显著[9]。但是关于薏苡仁抗炎的主要成分、相关靶点及主要作用机制仍不明确。因此本研究利用网络药理学[10]探究薏苡仁抗炎的主要活性成分、关键靶点及重要通路，并结合体外脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症模型实验验证其主要活性成分对炎性因子TNF-α和INF-γ的影响，为薏苡仁应用于炎症相关疾病的治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 小鼠RAW264.7巨噬细胞购于美国菌种保藏中心。

1.2 主要试剂 DMEM培养基、青-链霉素、胰蛋白酶购于美国Gibco公司，胎牛血清购于美国Clark Bioscience公司，LPS、β-谷甾醇标准品、四甲基偶氮唑蓝MTT购于美国Sigma公司，二甲基亚砜(DMSO)购于北京索莱宝科技有限公司，TNF-α、IFN-γ酶联免疫检测试剂盒(小鼠)购于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3 仪器设备 酶联免疫检测仪购于瑞士Tecan公司，CO2培养箱、台式高速离心机购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，倒置显微镜购于德国徕卡公司，高压蒸汽灭菌锅购于上海申安医疗器械厂。

1.4 方法

1.4.1 薏苡仁活性成分筛选及靶点预测：利用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)平台[11]获得薏苡仁的化学成分，选择OB≥30%且DL≥0.18的成分作为候选活性成分，并获得候选活性成分的mol2格式结构图，上传至PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)服务器，获取前300个靶点。将靶点蛋白导入UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库，获取靶点蛋白对应基因名。

1.4.2 免疫疾病相关靶点预测：在OMIM(https://www.omim.org/)数据库、GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库、DRUGBANK(https://www.drugbank.ca/)数据库中获取抗炎相关靶点。

1.4.3 获取交集基因：通过Venny 2.1.0在线分析工具获取潜在作用靶点。

1.4.4 薏苡仁-化学成分-潜在作用靶点网络构建：将“1.4.3”中获取的潜在作用靶点利用 Cytoscape 3.7.1软件构建“薏苡仁-活性成分-潜在靶点”相互作用网络。

1.4.5 关键靶点的互作：将“1.4.3”中潜在作用靶点导入String(https://string-db.org/)数据库，Organism设定为“Homo sapiens”，“highest confidence”≥0.9，根据Degree值排序，获得Degree值前十的靶点。

1.4.6 薏苡仁抗炎功能GO分析：通过DAVID(https//david.ncifcrf.gov/)数据库对薏苡仁抗炎功能的潜在作用靶点进行GO富集分析，限定“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，选取P<0.05的条目来评估生物过程(biological process，BP)，细胞组分(cellular component，CC)和分子功能( molecular function，MF)三个模块，并根据基因数排序，分别选取三个模块的前10条富集结果，导入微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平台进行可视化分析。

1.4.7 薏苡仁增强免疫功能代谢通路富集分析：应用DAVID平台对潜在作用靶点进行KEGG代谢通路富集分析，限定“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，根据富集分析的结果明确潜在作用靶点参与的代谢通路，进而明确该药治疗某种疾病的主要代谢通路，限定P<0.05，根据通路中所含的基因数进行排序，选取前15条通路导入微生信平台进行可视化分析。

1.5 实验验证 药物配制：将β-谷甾醇溶于DMSO后，用完全培养基(含10%胎牛血清的DMEM培养液)配制成200 μmol/L的β-谷甾醇母液，0.22 μm滤膜过滤除菌后，用完全培养基稀释成20、2、0.2、0.02、0.002 μmol/L的溶液。

1.5.1 细胞炎症模型：采用LPS(100 ng/ml)诱导RAW264.7细胞。取适当稀释的对数生长期细胞2 ml，加入6孔板，于5% CO2培养箱培养24 h。吸出孔内培养液，模型组加入2 ml完全培养基配制的100 ng/ml LPS溶液，LPS终浓度100 ng/ml；给药组加入1 mL不同浓度的β-谷甾醇溶液和1 ml完全培养基配制的200 ng/ml LPS溶液，β-谷甾醇溶液终浓度分别为10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L，LPS终浓度100 ng/ml；空白组为与给药组含相同量DMSO的完全培养基。重复3个孔，培养24 h后，收集上清，12 000 r/min离心，取上清液用于炎性因子的检测。

1.5.2 炎性因子检测：采用ELISA法检测RAW264.7细胞TNF-α和INF-γ的浓度，具体检测步骤参照说明书。450 nm下测定OD值，分别根据标准品浓度及各孔OD值绘制标准曲线回归方程，R2>0.99可用于下一步。将样本所测得OD值带入方程，计算待测样本中TNF-α和INF-γ的浓度。

2 结果

2.1 活性成分筛选及靶点预测 TCMSP数据库获得薏苡仁化学成分38个，其中OB≥30%且DL≥0.18的10个有效活性成分，其中薏苡仁内酯未找到其分子式，因此舍弃。最终获得9个有效活性成分，352个靶点。见表1。

表1 薏苡仁化学成分

2.2 免疫疾病相关靶点的筛选和预测 在DRUGBANK、TTD、OMIM数据库输入关键词“Inflammation”，分别获得相关靶点290、158、1 083个，去除重复项后共获得靶点840个。

2.3 获取交集基因 通过Venny 2.1.0在线分析工具对352个活性成分靶点和840个疾病靶点进行对比分析，获得50个潜在作用靶点。

2.4 薏苡仁-活性成分-潜在作用靶点网络构建 将活性成分及其对应潜在作用靶点信息导入Cytoscape 3.7.1软件构建“薏苡仁-活性成分-潜在靶点”相互作用网络。共60个节点，其中药材节点1个，活性成分节点9个，潜在靶点节点50个，共计365条连线。见图1。

图1 薏苡仁-活性成分-潜在靶点相互作用网络图;薏苡仁； 9个活性成分； 50个潜在靶点

2.5 薏苡仁抗炎潜在靶点PPI网络 将50个潜在作用靶点输入String数据库，构建相互作用网络模型。筛选整理Degree值前10的靶点包括SRC、CASP3、MAPK1、PPARG等，说明这些靶点可能在薏苡仁抗炎中起到了关键作用。见图2，表2。

表2 薏苡仁抗炎关键靶点

图2 薏苡仁抗炎PPI网络图

2.6 GO富集分析 基于DAVID数据库对潜在靶点进行GO分析，设定P<0.05，得到生物过程(BP，biological process)条目134个，细胞组分(CC，cellular component)条目18个，分子功能(MF，molecular function)条目55个，薏苡仁参与抗炎反应的生物学过程主要包括信号转导(signal transduction)、蛋白水解(proteolysis)、炎性反应(inflammatory response)、凋亡过程(apoptotic process)等，参与抗炎反应的分子功能主要包括蛋白质结合(protein binding)、ATP结合(ATP binding)、锌离子结合(zinc ion binding)、激酶活性(kinase activity)等。分别选取3个模块的前10条富集结果，导入微生信平台进行可视化分析。见图3。

图3 薏苡仁抗炎靶点GO分析

2.7 KEGG富集分析 通过DAVID数据库对潜在作用靶点进行KEGG分析，限定P<0.05，根据通路中所包含的基因数进行排序，选取前15条通路导入微生信平台进行可视化分析。薏苡仁抗炎的主要通路包括VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、癌症中心碳代谢( Central carbon metabolism in cancer) 、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、T细胞受体信号通路(T cell receptor signaling pathway)等。见图4。

图4 薏苡仁抗炎靶点KEGG富集分析

2.8 β-谷甾醇抗炎效果验证 LPS处理巨噬细胞组的INF-γ和TNF-α的表达量较高，分别为207.62和1 672.63 ng/L。与模型组相比，不同浓度β-谷甾醇(10、1、0.1、0.01、0.001 μmol/L)均有不同程度降低炎性因子的效果，且随着浓度的升高抑制效果增加，在10 μmol/L时抑制作用最明显，TNF-α和INF-γ的含量分别为1 022.35 ng/L、151.33 ng/L。见表3。

表3 炎性因子TNF-α和INF-γ浓度

3 讨论

炎症是免疫系统对有害刺激产生的一种应答反应，并通过消除有害刺激和启动愈合过程来发挥作用[12]。适度的炎性反应可以有效地减少即将发生的损伤或感染，有利于恢复组织稳态。然而，不受控制的急性炎性可能会转变成慢性炎性，进而导致多种疾病的发生[13]。因此，抗炎是多种疾病防治的重要路径。

巨噬细胞作为免疫系统的基本组成部分，是大多数组织中最丰富的免疫细胞，具有抗原呈递，免疫监视、调节、防御等多种功能[14]。此外，巨噬细胞在组织发育、维持组织稳态、组织修复、组织再生和清除凋亡细胞等过程中也发挥着重要的作用[15]。当病原体入侵时，巨噬细胞被激活并通过释放炎性因子来抵抗病原体，包括肿瘤坏死因子、白介素、干扰素等。然而，当这些炎性因子的产生得不到控制时，会对机体造成严重损伤，诱发多种疾病[16]。

Guo等[17]发现在体外实验中薏苡仁可以促进双歧杆菌和乳酸杆菌两种益生菌的生长，在体内实验中薏苡仁可以改善溃疡性结肠炎大鼠的肠道菌群结构，缓解体内溃疡性结肠炎的症状。Zhang等[18]研究表明薏苡仁可以改善类风湿性关节炎大鼠的症状，降低了促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1)的表达，并增加了抗氧化酶(GSH-Px、SOD 和 CAT)的活性。β-谷甾醇属于植物甾醇类化合物，广泛存在于天然植物中，被誉为“生命之钥”。Liu等[19]研究表明β-谷甾醇可以调节巨噬细胞极化并减轻小鼠的类风湿炎性。Yin等[20]研究表明，β-谷甾醇及其衍生物通过抑制小鼠的氧化和炎性来抑制脂多糖/d-半乳糖胺诱导的急性肝损伤。张冬阳[21]从薏苡仁中提取的β-谷甾醇具有抑制有害菌，田丹丹等[22]从牛油果中提取植物甾醇，发现其同样具有抑菌效果。

本研究查阅文献发现其中β-谷甾醇[23]具有显著的抗炎作用，β-谷甾醇可以显著抑制巨噬细胞的炎性因子TNF-α和IFN-γ的表达，且这种抑制作用呈剂量依赖性。薏苡仁抗炎的主要靶点包括SRC、CASP3、MAPK1、PPARG、STAT1、NOS3、LCK、PPARA、NOS2、KIT等，这些靶点可能是薏苡仁发挥抗炎作用的重要靶点。SRC基因编码的蛋白质是酪氨酸蛋白激酶，其可能在胚胎发育和细胞生长的调节中发挥作用，该基因的突变可能与结肠癌的恶性进展有关[24]。CASP3基因编码的蛋白质是一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，在细胞凋亡的过程中起着核心作用[25]。MAPK1基因是编码MAP激酶家族的一个成员，MAP激酶也称为细胞外信号调节激酶 (ERK)，作为多种生化信号的整合点，参与多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控和发育[26]。

综上所述，薏苡仁的抗炎作用是通过多成分、多靶点、多通路进行的，其活性成分与靶点、靶点与疾病靶点、靶点与信号通路之间均存在复杂的关系，对以上相关通路的预测还需通过实验进一步验证。