舒芬太尼对大鼠骨折愈合的影响

李玉斐 马智聪

舒芬太尼是芬太尼的衍生物，通过激动μ阿片受体发挥镇痛作用，其镇痛效果是芬太尼的5～10倍，且对呼吸和循环功能抑制较轻，可以降低应激反应因此被广泛运用于骨科术中及术后镇痛[1-3]。有研究证实舒芬太尼会抑制机体内P物质(SP)[5]、降钙素相关基因肽(CGRP)[7]及c-fos基因[6,7]等的表达，发挥镇痛作用，而这些基因和细胞因子在促进骨折愈合的过程中起到重要作用[5，8-13]。本实验给予胫骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼处理，旨在研究舒芬太尼对大鼠骨折愈合的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 48只健康雄性SD大鼠，6周龄，体重(200±25) g,由山西医科大学动物中心提供，所有SD大鼠分开饲养在相同鼠笼，每日摄食量相当，饮水不限，饲养温度控制在22℃，12 h光照和12 h黑暗交替,饲养1周。枸橼酸舒芬太尼注射液(厂家：人福医药，批号：11A05361)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠胫骨骨折模型的建立：SD大鼠经7%水合氯醛0.5 ml/100 g腹腔内注射麻醉后，于右小腿胫骨中下1/3处使用骨折装置制造横形骨折。在右腿胫骨平台处脱毛，碘伏消毒，切开皮肤后取适宜长度的0.8 mm克氏针从胫骨平台穿入髓腔，手法复位后逆行穿入骨折远端并固定，0.9%氯化钠溶液冲洗后缝合切口。术后大鼠肌内注射青霉素8万U/100 g，1次/d，连续肌内注射3 d，然后分笼饲养，死亡大鼠由备用同系大鼠在相同处理后补充。

1.2.2 实验分组及用药：将制备好胫骨骨折模型的48只SD大鼠随机分为实验组(腹腔注射舒芬太尼10 μg/kg,稀释至0.5 ml)和对照组(腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.5 ml)2组,每组24只,术后第1天起开始给药，每天早8∶00和晚20∶00给药，每次给药间隔12 h，2次/d。

1.2.3 实验标本采集及观察：术后第7天、14天、28天，分别从实验组和对照组随机选取8只大鼠，经水合氯醛腹腔注射麻醉后，颈动脉置管取血，将所取血液离心后取血清于-20℃冰箱保存。处死大鼠后取右下肢拍X线片观察骨折愈合程度。然后取右胫骨，剔除干净软组织，用4%多聚甲醛固定24 h后使用EDTA脱钙液脱钙1个月，在胫骨骨痂远近各1 cm处截取胫骨，脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡后，进行HE染色，显微镜下观察大鼠骨折部位的骨组织学特征。

1.2.4 ELISA法检验大鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)和转化生长因子β1(TGF-β1)水平。

1.2.5 免疫组化检测骨形态发生蛋白2(BMP-2)表达水平，电子显微镜下进行图像采集和分析。

2 结果

2.1 X线片比较

2.1.1 术后1周：实验组骨折线清晰可见；对照组断端稍模糊，出现轻度骨膜反应，但无骨痂生长。见图1。

实验组 对照组

2.1.2 术后2周：实验组骨折线较清晰；对照组骨折线模糊，有少量骨痂形成。见图2。

实验组 对照组

2.1.3 术后4周：实验组可见大量骨痂包绕断端，但仍能看到骨折线；对照组骨折线完全消失，断端可见大量外骨痂及少量骨桥连接骨折两端。见图3。

实验组 对照组

2.2 HE染色组织学比较

2.2.1 术后1周：实验组可见少量软骨细胞与成骨细胞；对照组可见大量软骨细胞形成和成骨细胞聚集现象，可见少量新生骨组织形成。见图4。

实验组 对照组

2.2.2 术后2周：实验组可见大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁数量较少,排列紊乱；对照组可见较多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁宽度、数量多于实验组。见图5。

实验组 对照组

2.2.3 术后4周:实验组有较多成纤维细胞形成，但成熟骨小梁仍较少；对照组有大量成纤维细胞和骨小梁形成，骨小梁明显增多、增厚，形成编织骨，并向成熟板层骨转化。见图6。

实验组 对照组

2.3 血清ALP及TGF-β1含量比较 与对照组相比，实验组大鼠血清碱ALP和TGF-β1含量在1周、2周、4周时均明显降低(P<0.05。见表1、2。

表1 舒芬太尼对胫骨骨折大鼠血清碱性磷酸酶含量的影响

表2 舒芬太尼对胫骨骨折大鼠血清转化生长因子β1含量的影响

2.4 骨折部位骨组织中BMP-2表达水平比较 与对照组相比，实验组大鼠BMP-2表达水平在1周、2周、4周时均明显降低(均P<0.05)。见表3，图7。

表3 舒芬太尼对胫骨骨折大鼠骨折部位BMP表达水平的影响

实验组 对照组 实验组

3 讨论

舒芬太尼是1974年合成,1976年被首次报道的芬太尼N2-4噻吩基衍生物，通过激动特异性μ阿片受体发挥镇痛作用[2]。舒芬太尼镇痛效价约为芬太尼5～10倍，是目前镇痛效应最强的阿片类药物，其脂溶性强，血浆蛋白结合率高，对呼吸系统、心血管系统及血流动力学抑制作用较芬太尼轻，被广泛运用于骨科、心血管外科及产科等手术和术后镇痛[3]。

舒芬太尼可以通过作用于人体大脑、脑干和脊髓等部位的阿片受体，抑制P物质(SP)、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、降钙素基因相关肽(CGRP)及c-fos基因等的表达，发挥镇痛作用。研究表明μ阿片受体激动剂可以通过使电压门控Ca2+通道失活抑制NMDA受体诱导的P物质释放[4]。P物质(SP)是一种神经递质，通过传递疼痛信息，激活伤害性感受神经元，发挥致痛作用。P物质可以作用于骨髓基质细胞上的NK-1受体，促进成骨细胞的增殖、分化，从而促进骨形成[8]；也作用于骨髓巨噬细胞上的NK-1受体，促进破骨细胞生成，从而促进骨吸收[9]，通过促进骨形成和骨吸收，加速骨转化，促进骨折愈合。王懿春等[5]实验证实鞘内注射舒芬太尼可以抑制大鼠脊髓背角N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体和降钙素基因相关肽(CGRP)的表达。降钙素基因相关肽作为疼痛因子参与多种慢性疼痛的形成，同时可以促进细胞内cAMP的产生，通过cAMP/PKA途径增加骨髓基质细胞的矿化和碱性磷酸酶的活性，促进成骨细胞的增殖[10]。降钙素基因相关肽(CGRP)还可以通过促进骨形态发生蛋白-2的表达，加速骨折愈合[11]。c-fos原癌基因属于即刻早期基因(IECs)家族，很多研究表明伤害性刺激可以诱导c-fos基因的表达，c-fos基因的表达产物Fos蛋白可与Jun蛋白结合形成fos/jun异源二聚体AP-1，识别细胞表面的TRE位点，启动TGF-β等因子的转录，进而促进骨折愈合[11，12]。而全身或局部应用阿片类药物会抑制大脑皮质、海马和脊髓c-fos基因的表达，且其抑制作用可以被阿片受体拮抗剂纳洛酮逆转[6,7]。

随着社会发展和交通工具的变革，骨折患者的数量越来越多，在积极治疗骨折的基础上，缓解骨折患者的疼痛也越来越重要。目前临床上常用的镇痛药物主要有非甾体抗炎药和中枢性镇痛药，大量研究表明非甾体抗炎药在镇痛的同时会延缓骨折愈合[14，15]。许多实验证实舒芬太尼会抑制骨折愈合相关的基因和细胞因子的表达，而关于中枢性镇痛药对骨折愈合的影响，笔者所见国内外鲜有报道，故本实验对胫骨骨折大鼠腹腔注射舒芬太尼处理，并与注射等量0.9%氯化钠溶液的空白组大鼠进行对比，旨在研究舒芬太尼时候会抑制骨折愈合。X线片显示术后1周时，实验组大鼠骨折线清晰可见，对照组大鼠骨折断端稍模糊，出现轻度骨膜反应，但无骨痂生长。术后2周时，实验组大鼠骨折线较清晰，对照组大鼠骨折线模糊，有少量骨痂形成。术后4周时，实验组大鼠可见大量骨痂包绕断端，但仍能看到骨折线，对照组大鼠骨折线完全消失，骨折断端可见大量外骨痂及少量骨桥连接骨折两端。HE染色组织学结果显示术后1周时，实验组可见少量软骨细胞与成骨细胞，对照组出现大量软骨细胞形成和成骨细胞聚集现象，可见少量新生骨组织形成。术后2周时，实验组可见大量新生骨小梁和新生血管形成，新生骨小梁数量较少,排列紊乱，对照组可见较多新生骨小梁和新生血管，且骨小梁宽度、数量多于实验组。术后4 周时，实验组有较多成纤维细胞形成，但成熟骨小梁仍较少，对照组有大量成纤维细胞和骨小梁形成，骨小梁明显增多、增厚，形成编织骨，并向成熟板层骨转化。

ALP可以分解有机磷酸化合物产生无机磷酸盐离子，并与钙离子结合成磷酸钙沉淀于骨组织内，促进骨折愈合。碱性磷酸酶由成骨细胞分泌后可以渗入血液，使血清碱性磷酸酶含量增高，故血清碱性磷酸酶可以作为评价骨折愈合的指标[16]。本实验中，实验组和对照组血清碱性磷酸酶含量1周时开始上升，2周时含量最高，4周时逐渐降低，且在术后1周、2周、4周时，实验组大鼠的血清碱性磷酸酶含量均低于对照组，结果有统计学意义。转化生长因子1(TGF-β1)广泛存在于正常细胞和转化细胞中，以骨细胞和血小板中含量最多。TGF-β1存在于大鼠骨折愈合的各个阶段，调控成骨细胞、破骨细胞、间充质细胞等多种骨细胞的增殖、分化，在骨折愈合过程中起到重要作用[17]。本实验中，血清TGF-β1含量在术后1周、2周、4周不断增高，且实验组大鼠的血清TGF-β1含量均低于对照组，结果有统计学意义。BMP是TGF-β超家族中的一种酸性多肽，也是目前最强的成骨因子，其中BMP-2是BMP中研究最多的亚型，也是成骨作用最强的亚型,可诱导间充质细胞向成骨细胞转化，促进骨折愈合[18]。 本实验中，在术后1周、2周、4周时，实验组大鼠的骨组织骨形态发生蛋白2表达水平均低于对照组，结果有统计学意义。

综上所述，舒芬太尼处理的胫骨骨折大鼠在影像学和组织形态学上骨折愈合程度低于单纯胫骨骨折大鼠，且同一时间段，舒芬太尼处理的胫骨骨折大鼠血清ALP含量、血清TGF-β1含量及骨组织BMP-2表达水平低于单纯胫骨骨折大鼠。故本实验证实舒芬太尼会抑制胫骨骨折大鼠的骨折愈合，应慎用于骨折患者的镇痛治疗，尤其是老年人、骨质疏松患者等易发生骨折延迟愈合或骨折不愈合的患者。舒芬太尼对骨折愈合的抑制作用可能是通过抑制P物质、降钙素基因相关肽及c-fos基因等的表达来实现的，关于舒芬太尼抑制骨折愈合的具体机制有待进一步研究。