金樱子总黄酮上调miR-1247-3p表达对缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的影响

刘晓东，刘晓琴，闫业军

急性心肌梗死是一种临床常见的疾病类型，目前采用经皮冠状动脉介入等手段进行治疗，当缺血心肌组织恢复供血后可加重心肌组织损伤，即心肌缺血再灌注损伤[1-2]。相关研究表明，中药具有抗氧化、抗凋亡等作用，可减轻心肌缺血再灌注损伤[3-4]。金樱子总黄酮(rosa laevigata michx total flavonoids，RLMTF)可减轻动脉内皮损伤，具有降低大鼠体内的氧化应激反应、保护血管内皮功能的作用[5]。金樱子总黄酮对缺氧/复氧(H/R)诱导心肌细胞损伤的影响尚未明确。微小RNA(miRNA)在心肌细胞损伤中发挥着重要的调控作用，有研究表明miR-1247-3p在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达下调，过表达miR-1247-3p可减轻H/R诱导的心肌细胞损伤[6]。本研究探讨金樱子总黄酮是否通过调控miR-1247-3p表达影响H/R诱导的心肌细胞损伤，以期为金樱子在心肌缺血再灌注损伤方面的作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 金樱子购自扶风斯诺特生物科技有限公司；大鼠心肌细胞H9C2购自上海研谨生物科技有限公司；Trizol试剂、cDNA合成及实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)试剂均购自美国Thermo Fisher；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent购自美国Invitrogen；miR-NC、miR-1247-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p购自广州锐博生物；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒购自南京建成生物；细胞凋亡检测试剂盒购自北京Solarbio；兔抗鼠Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9抗体与HRP标记的山羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥生物。

1.2 方法

1.2.1 金樱子总黄酮提取与制备[7]金樱子粉碎后过40目筛，取1.0 g粉末置于50 mL离心管内，加入30%乙醇和1%纤维素酶，充分混匀后封口，60 ℃恒温下水浴90 min，之后置于90 ℃恒温水浴锅内，灭活酶30 s，提取金樱子总黄酮(纯度73%)，加入二甲基亚砜(DMSO)溶解后稀释，浓度分别为0.12 mg/mL、0.24 mg/mL、0.48 mg/mL。

1.2.2 实验分组 将H9C2细胞接种于不含血清的低糖DMEM培养基，置于37 ℃低氧密闭培养箱(95%N2+5%CO2)内缺氧处理3 h，之后以含10%胎牛血清的高糖DMEM置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内复氧处理4 h[8]，作为H/R组。同时将正常培养的H9C2细胞作为Con组。H9C2细胞接种于96孔板(每孔3×103个)，分别加入含有浓度为0.12 mg/mL、0.24 mg/mL、0.48 mg/mL金樱子总黄酮的培养基，维持24 h后进行H/R处理，分别作为H/R+RLMTF-L组、H/R+RLMTF-M组、H/R+RLMTF-H组。采用脂质体转染法将miR-NC、miR-1247-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p分别转染至H9C2细胞，转染成功后，转染miR-NC、miR-1247-3p mimics的细胞进行H/R处理，转染anti-miR-NC、anti-miR-1247-3p的细胞，加入0.48 mg/mL金樱子总黄酮，维持24 h后进行H/R处理，分别作为H/R+miR-NC组、H/R+miR-1247-3p组、H/R+RLMTF+anti-miR-NC组、H/R+RLMTF+anti-miR-1247-3p组。

1.2.3 试剂盒检测MDA水平与SOD、GSH-Px活性 收集各组H9C2细胞，采用反复冻融法裂解细胞，利用试剂盒严格按照说明书检测MDA水平与SOD、GSH-Px活性。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组H9C2细胞在冰磷酸缓冲盐溶液(PBS)中洗涤，悬浮于500 μL Binding Buffer，之后在室温避光处与膜联蛋白-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)各5 μL，充分反应10 min，应用流式细胞仪检测各组H9C2细胞凋亡率。

1.2.5 qRT-PCR检测miR-1247-3p表达水平 采用Trizol试剂从各组H9C2细胞中制备总RNA。反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测Ct值，并采用2-ΔΔCt法计算miR-1247-3p相对表达量。

1.2.6 免疫印迹法(Western Blot)检测Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白表达量 以500 μL RIPA裂解液从各组H9C2细胞中制备总蛋白，取40 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜、封闭后加入Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9一抗(1∶1 000)与内参GAPDH抗体稀释液(1∶2000)4℃孵育12h，加入稀释比为1∶3 000的二抗稀释液室温孵育2 h，暗室内曝光显影，应用Quantity One软件对Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白条带进行定量分析。

2 结 果

2.1 金樱子总黄酮抑制H/R诱导的心肌细胞氧化应激 与Con组比较，H/R组MDA水平升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+RLMTF-L组、H/R+RLMTF-M组、H/R+RLMTF-H组MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。详见表1。

表1 金樱子总黄酮对H/R诱导的心肌细胞氧化应激的影响(±s，n=3)

2.2 金樱子总黄酮对H/R诱导心肌细胞凋亡的影响 与Con组比较，H/R组细胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.05)；与H/R组比较，H/R+RLMTF-L组、H/R+RLMTF-M组、H/R+RLMTF-H组细胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.05)，且呈剂量依赖性。详见图1、表2。

图1 金樱子总黄酮对H/R诱导心肌细胞凋亡的影响 (A为凋亡相关蛋白表达条带图；B为心肌细胞凋亡流式图)

表2 金樱子总黄酮对H/R诱导心肌细胞凋亡的影响(±s，n=3)

2.3 金樱子总黄酮对H/R诱导心肌细胞miR-1247-3p表达的影响 H/R组miR-1247-3p表达量较Con组降低(P<0.05)；相较于H/R组，H/R+RLMTF-L组、H/R+RLMTF-M组、H/R+RLMTF-H组miR-1247-3p表达量升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性。详见表3。

表3 金樱子总黄酮对H/R诱导心肌细胞miR-1247-3p表达的影响(±s，n=3)

2.4 miR-1247-3p过表达保护H/R诱导心肌细胞损伤的影响 与H/R+miR-NC组比较，H/R+miR-1247-3p组MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性增强(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平降低(P<0.05)。详见图2、表4。

图2 miR-1247-3p过表达抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡(A为miR-1247-3p过表达影响H/R诱导的心肌细胞凋亡相关蛋白表达条带图；B为miR-1247-3p过表达和H/R诱导的心肌细胞凋亡流式图)

表4 miR-1247-3p过表达保护H/R诱导的心肌细胞损伤(±s，n=3)

2.5 干扰miR-1247-3p表达逆转金樱子总黄酮(0.48 mg/mL)对H/R诱导心肌细胞损伤的影响 与H/R+RLMTF+anti-miR-NC组比较，H/R+RLMTF+anti-miR-1247-3p组MDA水平升高(P<0.05)，SOD活性、GSH-Px活性减弱(P<0.05)，细胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高(P<0.05)。详见图3、表5。

图3 干扰miR-1247-3p表达逆转金樱子总黄酮(0.48 mg/mL)对H/R诱导心肌细胞凋亡的影响(A为干扰miR-1247-3p表达、金樱子总黄酮和H/R诱导的心肌细胞凋亡相关蛋白表达条带图；B为干扰miR-1247-3p表达、金樱子总黄酮和H/R诱导的心肌细胞凋亡流式图)

表5 干扰miR-1247-3p表达逆转了金樱子总黄酮对H/R诱导心肌细胞损伤的影响(±s，n=3)

3 讨 论

金樱子属于蔷薇科，蔷薇属绿灌木的果实，金樱子总黄酮是其主要活性成分，黄酮类化合物常表现出抑制自由基生成、抗肿瘤等功能，金樱子总黄酮可抑制氧化应激及炎症反应，减轻肝组织缺血/再灌注损伤[9]。金樱子总黄酮可抑制氧化应激、炎症反应，减轻肾缺血再灌注损伤[10]。金樱子总黄酮可减轻脂多糖诱导的小鼠肝损伤[11]。但其对H/R诱导心肌细胞损伤的影响尚未明确。本研究结果显示，H/R诱导的心肌细胞MDA水平升高，SOD、GSH-Px活性降低，与相关研究报道结果[12]相近，提示成功构建心肌缺血再灌注损伤模型。进一步研究显示，在H/R诱导心肌细胞中，金樱子总黄酮呈剂量依赖性减轻氧化应激，该结果由MDA水平下调和SOD、GSH-Px活性上调证实。本研究结果表明，H/R诱导的心肌细胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平升高，与相关研究报道结果[13]相近。金樱子总黄酮可降低H/R诱导心肌细胞凋亡率和Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 9蛋白水平，提示金樱子总黄酮保护H/R诱导的心肌细胞损伤与抑制细胞凋亡密切相关。

miR-1247-3p在缺氧缺糖/再复氧诱导的神经细胞中表达下调，恢复其表达可减轻细胞凋亡，进而改善细胞缺氧缺糖/再复氧损伤[14]。本研究结果显示，在心肌细胞中H/R下调miR-1247-3p水平，金樱子总黄酮可提高H/R诱导心肌细胞miR-1247-3p表达量，且呈剂量依赖性，提示金樱子总黄酮可能通过上调miR-1247-3p表达，减轻H/R诱导心肌细胞损伤。本研究结果显示，miR-1247-3p过表达可降低MDA水平和细胞凋亡率，SOD、GSH-Px活性升高；干扰miR-1247-3p表达部分削弱了金樱子总黄酮抑制H/R诱导的心肌细胞氧化应激及抑制细胞凋亡的结果。上述结果表明，金樱子总黄酮通过调控miR-1247-3p表达减轻H/R诱导的心肌细胞损伤。

综上所述，金樱子总黄酮通过促进miR-1247-3p表达，抑制H/R诱导的心肌细胞氧化应激及凋亡，从而减轻细胞损伤，miR-1247-3p可能作为金樱子总黄酮减轻心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点。具体作用机制仍需进一步深入研究。