Bna-miR43-FBXL调控模块参与甘蓝型油菜铝胁迫的功能分析

张盈川 吴晓明玉 陶保龙 陈 丽,2 鲁海琴 赵 伦 文 静 易 斌 涂金星 傅廷栋 沈金雄,*

Bna-miR43-FBXL调控模块参与甘蓝型油菜铝胁迫的功能分析

张盈川1吴晓明玉1陶保龙1陈 丽1,2鲁海琴1赵 伦1文 静1易 斌1涂金星1傅廷栋1沈金雄1,*

1华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室 / 国家油菜工程技术研究中心, 湖北武汉 430070;2长江师范学院现代农业与生物工程学院, 重庆 408100

在酸性土壤中, 铝是制约作物生长和产量的一个重要因素, 如何利用酸性土地意义重大。本研究的对象是前期本课题鉴定到的一个未被报道的miRNA——Bna-miR43。系统地对甘蓝型油菜中Bna-miR43及其靶基因进行生物信息学分析以及表达模式鉴定, 并构建Bna-miR43过表达载体探讨了Bna-miR43-FBXL模块在甘蓝型油菜响应铝胁迫的分子机制。5¢-RACE结果表明Bna-miR43在甘蓝型油菜中真实切割、。生物信息学分析表明,、在拟南芥中的同源基因为, 编码含F-box的E3泛素连接酶。qRT-PCR结果显示, Bna-miR43及其靶基因在甘蓝型油菜不同组织以及铝胁迫瞬时处理下的表达水平存在此消彼长的现象。油菜转基因试验表明, Bna-miR43的过表达株系地上部分长势良好, 体内积累了较少的MDA和H2O2, 同时转基因植株根系的铝积累量较对照少。本研究结果为甘蓝型油菜中铝胁迫响应提供参考。

甘蓝型油菜; Bna-miR43; F-box; 铝胁迫

铝是土壤中最丰富的金属元素, 当土壤pH<5时, 铝以Al3+的形态存在于土壤中[1]。酸性土壤中, Al3+是制约作物产量和品质的主要因素[2]。植物在受到铝毒后, Al3+会迅速造成根尖损伤, 根系从土壤中吸收水分和养分的能力降低[3]。植物应对铝胁迫主要有2种方式: 诱导Al3+的外排和Al3+内部耐受[4-5]。植物诱导Al3+外排主要是通过根系分泌柠檬酸、苹果酸和草酸和Al3+螯合, 将其从根部排出[6-7]。植物对Al3+内部耐受则是通过提高细胞抗氧化能力或将Al3+隔离在液泡中。拟南芥在受到铝胁迫后, 体内多种抗氧化酶的活性增加, 减少了体内活性氧的积累。水稻铝转运蛋白可将根尖细胞吸收的Al3+隔离在液泡中, 在调控水稻耐铝性中起重要作用[8-10]。转录因子STOP1 (SENSITIVE TO PROTEIN RHIZOTOXICITY 1)在植物响应铝胁迫的信号转导通路中必不可少[4]。一方面, STOP1可以调节促进根系外排Al3+的基因的表达, 例如苹果酸转运蛋白基因, 促进根系外排Al3+; 另一方面, STOP1作为转录因子可以激活其他响应氧化应激反应的基因的表达,增加植物对Al3+的耐受度[11-12]。

植物micro RNA (miRNA)是一类内源非编码小分子RNA, 其主要通过负调控靶基因从而行使功能[13]。目前, 关于miRNA参与植物响应铝胁迫已被陆续报道。水稻中miR168、miR528、miR399在受到铝胁迫后均上调, 通过不同的生物途径缓解铝毒[14]。大豆中通过高通量测序鉴定到了30个可以响应Al3+的miRNA, 通过对这些miRNAs的靶基因进行鉴定,发现靶基因多参与到氧化应激反应中[15]。拟南芥中miR160、miR164可以通过负调控靶基因参与控制拟南芥根系的生长, 在拟南芥受到铝胁迫后发挥重要作用[16]。

尽管目前已在甘蓝型油菜中鉴定到许多miRNA, 但关于响应铝胁迫的miRNA尚未有较多报道, miRNA调控响应铝胁迫的机制仍需进一步探索。本研究前期通过小RNA测序在甘蓝型油菜中鉴定到了一个新miRNA (Bna-miR43), 通过生物信息学分析、表达模式鉴定以及转基因油菜表型观察, 揭示了Bna-miR43在甘蓝型油菜响应铝胁迫中的作用, 为完善甘蓝型油菜miRNA响应铝胁迫的调控网络提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验中降解组测序所用材料为角果性状存在较大差异的甘蓝型油菜株系08-8008和4942高世代回交群体BC5中的长角果油菜以及短角果油菜在开花初期、0～7 d雌蕊、0～7 DAP角果混样测序; 构建RLM-5¢RACE文库所使用的油菜为上述长角果油菜和短角果油菜0～7 DAP角果的混池; 转基因受体材料为甘蓝型油菜J572。

1.2 试验方法

1.2.1 RLM-RACE验证靶基因切割位点 使用FirstChoice RLM-RACE (Invitrogen, 美国)试剂盒构建RLM-RACE文库, 构建文库具体方法参照说明书。以构建的RLM-RACE文库为模板, 进行2轮nested PCR, 选择正确大小的目的片段进行TA克隆测序, 并确定其切割位点, 具体步骤参照说明书。

1.2.2 基因家族生物信息学分析 使用DNAMAN软件对目的序列进行比对; 利用甘蓝型油菜数据库确定RLM-RACE验证到的靶基因属于FBXL基因家族; 利用NCBI数据库筛选甘蓝型油菜FBXL基因家族序列; 用Pfam网站与hmmresearch对FBXL基因家族隐马尔可夫模型搜索鉴定确定最终家族成员; 使用clustalw软件对家族成员的蛋白序列比较分析后, 使用iqtree软件绘制FBXL基因家族系统发育进化树; 使用The MEME Suite网站的MEME分析工具对FBXL基因家族的保守基序进行分析; 使用TBtools绘制FBXL基因家族保守基序与基因结构图;根据MUSCLE 在线工具(https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/muscle/)分析序列同一性, 并使用R语言中corrplot程序包绘制序列同一性图。

1.2.4 油菜下胚轴遗传转化 具体方法参考陈丽[17]。

1.2.5 植物总RNA提取 TRIzol试剂(Invitrogen, 美国)提取总RNA。

1.2.6 miRNA及靶基因的反转录和定量 利用茎环法对miRNA进行反转录[18]。使用Vazyme的miRNA引物设计软件, 对Bna-miR43的反转录引物和定量PCR引物进行设计。miRNA反转录试剂盒采用miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop) (Vazyme, 南京), qRT-PCR采用Vazyme公司的miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix。靶基因的反转录采用RevertAid RT试剂盒(Thermo Scientific, 美国), 靶基因荧光定量采用MonAmp qPCR Mix。miRNA内参为U6, 靶基因内参为, 扩增程序参考说明书。根据2-ΔΔCt方法计算相对表达量[19]。

1.2.7 铝胁迫瞬时处理Bna-miR43表达量检测 选取饱满一致的J572油菜种子, 表面消毒后放入网格状播种盒中在霍格兰营养液中培养2周后, 转入0.5 mmol L–1CaCl2、50 μmol L–1AlCl3(pH 4.5)的溶液中, 分别在0、2、4、8、12、24 h取样, 均取3个生物学重复, –80℃保存以便后续qRT-PCR。

1.2.8 转基因植株铝胁迫表型鉴定 挑选均匀一致的J572油菜与转基因油菜种子, 表面消毒后, 放入培养皿中进行催芽, 待幼芽发育7 d后, 将其移至水培盒中固定生长, 生长至3周后选取发育状态相同, 均匀一致的幼苗, 使用海绵将油菜幼苗固定再装有培养液的锥形瓶(表面黑暗处理)中, 对照组用0.5 mmol L–1CaCl2(pH 4.5)的溶液培养, 处理组用0.5 mmol L–1CaCl2、300 μmol L–1AlCl3(pH 4.5)的溶液培养, 处理时间为7 d。

1.2.9 油菜根系过氧化氢和丙二醛含量检测 使用H2O2含量检测试剂盒(Solarbio, 北京), 测定油菜组织过氧化氢含量; 使用MDA含量检测试剂盒(Solarbio, 北京), 测定油菜组织丙二醛含量。随机取不同株系的3株油菜新鲜根系, 测定方法参照说明书。

研究对象小行星Toutatis和探测器Viking，根据现有材料中的描述以及图片信息，采用Solidworks软件进行建模，其特征化以及参数化等特点，能够胜任复杂模型建模，在航空、船舶、模具等工业领域应用广泛[2]。

1.2.10 苏木精染色观察根系铝分布情况 配置0.2%苏木精染色液: 0.2 g苏木精粉末和0.02 g碘化钾(KI)用少量去离子水溶解, 定容至100 mL。将铝胁迫处理7 d后的油菜根系用去离子水浸泡冲洗3～4次, 清除附着在根系表面的铝离子, 放入配置好的0.2%苏木精工作液中完全浸泡, 避光染色30 min。染色完成后, 使用去离子水反复去除多余染液, 使用体式显微镜观察根系染色情况并照相[20]。

2 结果与分析

2.1 Bna-miR43基本信息及其靶基因验证

本实验室前期对2个角果长度差异较大的甘蓝型油菜株系进行小RNA和降解组测序, 结果在2个文库中均鉴定到Bna-miR43 (附表1), 同时降解组测序结果显示Bna-miR43对靶基因的切割效率很高[17]。利用RNAFold绘制Bna-pre-miR43的二级结构(图1), 其前体可以形成茎环结构, 最小自由能为–24.37 kcal mol–1。在甘蓝型油菜数据库中进行对比发现, 前体序列位于甘蓝型油菜C03染色体的5,010,729～5,010,920位置, 位于基因间隔区。上述特征均符合miRNA的基本特征。

图1 Bna-miR43前体结构预测图

箭头所指处为Bna-miR43成熟体序列。

Arrow indicates Bna-miR43 mature sequence.

降解组测序鉴定到Bna-miR43的4个候选靶基因均为F-box家族蛋白。对降解组测序数据进行分析, 通过对Bna-miR43剪切位点进行分析, 可根据pvalue值对靶基因进行分类。4个候选靶基因均属于Category0, 说明Bna-miR43对靶基因的切割效率高, 可靠性高(表1)。RLM-RACE验证Bna-miR43的候选靶基因, 表明Bna-miR43在甘蓝型油菜中真实切割(图2)。

2.2 Bna-miR43靶基因与拟南芥同源基因序列比对分析

将RLM-RACE验证到的油菜靶基因与拟南芥同源序列进行比对。DNAMAN比对结果如图3, 2个靶基因与拟南芥同源基因()序列高度相似、序列保守性强, 并且其结构域相同, 均在C端含LRR结构域, 属于FBXL家族。因此推测Bna-miR43的靶基因与拟南芥同源基因()在植物中可能行使相似功能。

表1 Bna-miR43降解组预测靶基因情况概述

Table 1 Overview of Bna-miR43 target genes predicted from degradome sequencing

图2 RLM-RACE验证靶基因定向切割位点

图中箭头表示切割位点, 数字表示挑斑克隆验证目标mRNA切割位点的克隆频率。

The arrow indicates the cleavage site in the target genes, the number represents the frequency of clones to validate the cleavage sites of target mRNA.

2.3 Bna-miR43靶基因家族生物信息学分析

2.3.1 FBXL基因家族在甘蓝型油菜中的进化分析 根据BnTIR网站中BLAST工具搜索和hmmreash对隐马尔可夫模型搜索分析, 最终在甘蓝型油菜中鉴定到39个FBXL基因家族成员。为确定甘蓝型油菜FBXL基因家族的进化关系, 对39个FBXL基因家族成员构建系统发育树。结果显示, 39个甘蓝型油菜FBXL基因被分为4组(组I、II、III、IV)。I亚组包含6个成员, II亚组包含11个成员, III亚组包含13个成员, IV亚组包含9个成员。总体而言, 分组为同一亚组的基因可能具有相似功能。值得注意的是, 靶基因和两个成员均分布在II组中(图4-A)。

2.3.2 甘蓝型油菜FBXL亚族基因结构与Motif元件分析 根据FBXL基因家族进化分析结果(图4-A), 对靶基因所在的II亚族进行保守基序分析。从的BLAST结果中选取-value值为0的2个拟南芥FBXL蛋白(、)做进一步比较。采用The MEME Suite网站提供的MEME分析工具分析13个亚族成员(含2个拟南芥同源基因)的保守基序。结果显示(图4-B), 除和缺少motif5, 以及、、缺少motif4外, 其余成员均包含所有基序。其中motif1组成油菜F-box结构域, motif2组成LRR结构域。

图3 油菜靶基因和拟南芥同源基因序列比对结果

图4 油菜FBXL基因家族进化分析

A: 油菜FBXL基因家族系统发育进化树; B: F-box家族的基因结构与motif。

A: phylogenetic tree of FBXL gene family in; B: the gene structure and motif of F-box family.

使用TBtools对靶基因所在亚族进行基因结构分析, 根据基因注释文件绘制基因结构图。其中I组和III组中的所有成员以及III组中的除、、基因均含有7个或8个外显子。拟南芥基因长度最长, 油菜长度最短, 另有部分成员不存在5¢UTR结构。

2.3.3 甘蓝型油菜FBXL亚族基因序列相似性分析 为分析甘蓝型油菜FBXL亚族基因序列的相似性, 使用MUSCLE 工具以默认设置比对FBXL亚族成员蛋白序列全长同一性。结果显示。、、、、5个基因序列同一性均超过80%,、、3个基因有较高同一性,、、、4个基因序列同一性较高(图5)。表明和序列相似性为95%, 即这2个基因在油菜生长发育过程中可能行使相似的功能。

图5 FBXL亚族基因序列同一性分析

2.4 Bna-miR43及靶基因在甘蓝型油菜不同组织及铝胁迫瞬时表达模式分析

在甘蓝型油菜J572不同组织器官对Bna-miR43以及其靶基因进行表达量检测(图6)发现, Bna- miR43和靶基因、在根、茎、叶、花、角果中均有表达。其中Bna-miR43在花和角果中的表达量最高, 分别是根中表达量的50倍和250倍。在花中的表达量最高;在茎中的表达量最高,、均在叶中的表达量最低。Bna-miR43和靶基因的组织特异性表达分析表明, Bna-miR43对靶基因存在一定的调控作用, 两者之间存在一定的此消彼长的关系。

Bna-miR43的靶基因属于FBXL家族, 其拟南芥同源基因可响应铝胁迫, 泛素化降解STOP1[11]。为鉴定Bna-miR43是否受铝胁迫的诱导表达。对甘蓝型油菜J572进行铝响应瞬时试验, 在不同时段取样进行表达分析。结果显示, 在J572受到铝胁迫后, Bna-miR43表达水平逐渐升高, 与第0小时(未胁迫对照)相比, 铝处理第24小时的J572中Bna- miR43的表达量上调了10倍左右。而靶基因的表达水平恰好相反, 随着铝处理时间的增加,、的表达量逐渐降低, 受到抑制(图7-A)。表明在铝胁迫下, Bna- miR43会被诱导表达从而对靶基因的表达产生抑制作用。

图6 Bna-miR43及其靶基因在甘蓝型油菜不同组织中的表达分析

每次试验3次生物学重复, 3次技术重复。*和**分别表示显著水平(< 0.05)与极显著水平(< 0.01)。

Three biological replicates and three technical replicates per experiment. *:< 0.05; **:< 0.01.

图7 Bna-miR43及其靶基因表达量分析

A: 铝胁迫下甘蓝型油菜J572中Bna-miR43及其靶基因的表达模式; B: 过表达Bna-miR43转基因油菜基因表达量分析。每次试验3次生物学重复, 3次技术重复。*和**分别表示显著水平(< 0.05)与极显著水平(< 0.01)。

A: the expression level of Bna-miR43 and its target genes ofunder Al stress; B: gene expression of over expression Bna-miR43 transgenic rapeseed. Three biological replicates and three technical replicates per experiment, *:< 0.05; **:< 0.01.

2.5 Bna-miR43在甘蓝型油菜铝胁迫中的功能验证

为进一步验证Bna-miR43是否在甘蓝型油菜中参与响应铝胁迫, 构建了Bna-miR43的过表达材料, 对Bna-miR43过表达植株检测基因表达量, 结果如图7-B所示。转基因株系中Bna-miR43的表达量上调了10～50倍左右, 而2个靶基因的表达量则显著下调。

将T1代转基因油菜的阳性株系和对照J572同时进行铝胁迫, 对地上部分表型观察。未进行铝胁迫处理的J572与转基因油菜材料植株形态和叶片状态相同, 均为嫩绿色, 植株长势正常。铝胁迫处理后, J572与Bna-miR43过表达植株均出现一定程度的萎蔫, 叶片失绿、皱缩, 植株长势异常。其中叶片失绿和萎蔫首先表现在老叶上。J572对铝胁迫耐受度低于转基因油菜, 表现为叶片严重失绿呈现紫红色并伴有皱缩现象, 植株严重萎蔫; Bna-miR43过表达阳性植株叶片轻微失绿, 部分叶片颜色变紫, 植株轻度萎蔫(图8-A, B)。说明过表达Bna-miR43能有效减轻铝胁迫对油菜地上部分的毒害。

为直观展示铝胁迫后油菜根系中的铝分布状况,对未进行铝胁迫油菜与铝处理1周后的油菜根系进行苏木精染色。结果表明, 铝胁迫后J572根系染色最深, 根尖、分生区、伸长区和成熟区的细胞均为深蓝色, 铝离子几乎分布整个根部; 铝胁迫后的转基因油菜根系染色比J572较浅, 其中颜色较深区域为根尖和伸长区, 其余区域均为浅蓝色(图8-C)。表明, 铝胁迫影响油菜根系生长, 铝离子进入油菜根系后主要富集在根尖以及伸长区, 对根尖以及伸长区破坏力较强; 铝胁迫下Bna-miR43转基因油菜材料根系中的铝含量低于J572。

2.6 铝胁迫下油菜生理生化指标分析

膜脂过氧化程度通常会作为植物受非生物胁迫的损害指标, 植物体内积累的MDA含量越高, 说明植物受到的氧化损伤越大。对铝胁迫处理后和未进行铝胁迫处理的转基因油菜和J572油菜材料根系取样, 检测根系MDA含量。未进行铝胁迫处理的转基因油菜材料根系MDA含量与对照组J572没有显著性差异, 而铝胁迫处理的转基因油菜根系MDA含量显著低于J572油菜根系MDA含量(图9-A), 表明Bna-miR43过表达植株受到的氧化损伤较对照轻。

过氧化氢是植物体内常见的一种活性氧, 是一种植物氧化应激反应调节因子。过量的过氧化氢在细胞中积累会对细胞膜造成损伤并加速细胞衰老和死亡。铝胁迫处理后转基因植株的过氧化氢含量显著低于对照(图9-B)。表明过表达Bna-miR43能够提高油菜的抗氧化能力。

图8 铝处理J572和Bna-miR43过表达转基因植株表型鉴定

A: 未进行铝处理油菜植株地上部分表型分析; B: 铝处理后的油菜植株地上部分表型分析, 随机取5株同一株系不同油菜植株的倒一叶照相, 其中地上部分表型图标尺为5 cm, 倒一叶图标尺为2 cm; C: 苏木精染色鉴定根中铝分布。–Al3+: J572在0.5 mmol L–1CaCl2(pH 4.5)的培养液中培养1周后, 使用苏木精染色, 体式显微镜观察拍照。+Al3+: 转基因油菜与J572在0.5 mmol L-1CaCl2, 300 μmol L–1AlCl3(pH 4.5)培养液中处理1周后, 使用苏木精染色, 体式显微镜观察照相, 左侧图标尺为1 mm, 右侧图标尺为0.5 mm。

A: the untreated rapeseed material. B: rapeseed material treated with Al. The bottom leaves of the same strain were randomly taken for pictures, and each strain choose five rapeseed, in the pictures of above ground portion, bar: 5 cm; the bottom leaf, bar: 2 cm. C: the distribution of aluminum in root by hematoxylin dyeing, –Al3+: J572 was cultured in 0.5mmol L-1CaCl2(pH 4.5) for one week, then stained with hematoxylin, observed with stereo microscope and photographed. +Al3+: transgenic rapeseed and J572 were treated in 0.5 mmol L–1CaCl2,300 μmol L–1AlCl3(pH 4.5) for one week, then stained with hematoxylin, observed and photographed by stereo microscope, on the left side of the figure, bar: 1 mm, on the right side of the figure, bar: 0.5 mm.

图9 过表达Bna-miR43油菜根系铝胁迫后生理生化指标分析

A: 过表达Bna-miR43油菜根系铝胁迫后MDA含量分析; B: 过表达Bna-miR43油菜根系铝胁迫后过氧化氢含量分析。每次试验3次生物学重复, 3次技术重复。*和**分别表示显著水平(< 0.05)与极显著水平(< 0.01)。

A: MDA content in roots of Bna-miR43-overexpressed transgenic rapeseed after Al stress; B: hydrogen peroxide content in roots of Bna-miR43-overexpressed transgenic rapeseed after Al stress. Three biological replicates and three technical replicates per experiment, *:< 0.05; **:< 0.01.

3 讨论

3.1 Bna-miR43及其靶基因

本研究通过对2个角果长度差异较大的甘蓝型油菜进行小RNA测序, 鉴定到了Bna-miR43。对Bna-miR43的前体分析发现, 其位于和的间隔区, 即Bna-miR43有自己的启动子, 以独立的转录单位存在于甘蓝型油菜的基因组上。通过5¢-RACE验证到Bna-miR43 对靶基因、存在真实切割。对Bna-miR43及靶基因在甘蓝型油菜J572的各个组织器官进行表达量分析, 结果显示Bna- miR43及其靶基因、在甘蓝型油菜的不同组织均有表达, 这说明Bna-miR43及其靶基因可能在甘蓝型油菜的多个发育阶段都具有调节功能。其中, 值得注意的是Bna- miR43在花和角果中的表达量较高, 这可能是由于本试验中测序用的组织器官为花和角果, 因此可能会更容易鉴定到在花和角果中表达量高的miRNA。Bna-miR43和靶基因的组织特异性表达结果表明, Bna-miR43对靶基因存在一定的负调控作用。

3.2 靶基因生物信息学分析

FBXL是F-box家族中的一个亚家族, 其特点是C末端具有不同的亮氨酸重复序列(LRR), FBXL基因家族通常与植物响应逆境胁迫相关[21-23]。通过对、和拟南芥的同源基因进行生物信息学的研究, 发现其均属于FBXL基因家族。、和拟南芥同源基因序列和保守基序均具有较高相似性, 推测靶基因与拟南芥同源基因在植物生长发育过程中起到相似作用[22], 即作为FBXL家族蛋白, 通过泛素化的方式参与到植物响应铝胁迫中。基于此我们构建Bna-miR43过表达载体转化油菜作进一步验证。

3.3 Bna-miR43在响应铝胁迫中的作用

对拟南芥数据库查询并进行拟南芥同源基因的蛋白互作分析,基因与C2H2型锌指转录因子STOP1相互作用并促进其泛素化降解。C2H2型转录因子STOP1是铝抗性所必需的, 它通过诱导植物铝抗性基因表达从而增加植物对铝胁迫的耐受度[24]。同时STOP1在转录后和翻译后水平受铝胁迫的调控, 拟南芥FBXL蛋白RAE1参与了STOP1的泛素化降解[24-25], 由此推测, Bna-miR43可能通过调控靶基因(FBXL)参与响应铝胁迫。

水稻中研究发现, 450 μmol L–1Al3+处理8 h后, 籼稻中有5个miRNA显著下调, 3个miRNA显著上调; 粳稻有13个显著下调, 6个显著上调[14]。对甘蓝型油菜J572进行铝胁迫处理, 对Bna-miR43和靶基因、的表达模式分析。结果表明, 铝胁迫后Bna-miR43的表达量逐渐上升; 靶基因、表达量则与Bna-miR43的表达模式相反, 随着铝胁迫处理时间的增加,、表达量均下降。铝胁迫下, Bna-miR43及其靶基因的表达差异说明, 铝胁迫能够诱导Bna-miR43表达, Bna-miR43表达量上升导致靶基因(FBXL家族蛋白)表达量下降。靶基因表达量的降低可能减少了FBXL 蛋白对STOP1转录因子的泛素化降解, 进而提高油菜耐铝性。

基于表达量分析结果, 对过表达Bna-miR43转基因阳性苗进行铝胁迫。根据表型观测结果和生理指标测定结果得出, 过表达Bna-miR43转基因植株对铝的耐受性高于J572。植物受到铝胁迫后对首先影响根系的生长[26-27]。拟南芥中有研究发现, 在突变体中编码苹果酸转运蛋白的基因的表达量被下调, 根系外排Al3+的能力减弱导致突变体对铝不耐受[11]。同时, STOP1在其他植物中的直系同源同样可以在铝胁迫下调节铝耐受基因的表达[28]。本实验通过对根系进行苏木精染色, 发现J572根系受到铝胁迫后积累了较转基因株系更多的Al3+, 说明FBXL的降低可能增加了STOP1在甘蓝型油菜中的蛋白丰度, 促进了油菜根系Al3+的外排。研究表明, Al3+引起的氧化损伤主要是由于植物受到氧化应激导致体内的活性氧含量增加[8]。铝胁迫会激活NADPH氧化酶, 导致H2O2的含量显著增加[29]。活性氧的过量积累会激活铝耐受相关基因的表达, 使植物在铝诱导的ROS损伤中得以恢复[30]。在铝胁迫之前Bna-miR43过表达株系和J572的MDA和H2O2含量大致相同, 在铝胁迫之后MDA和H2O2含量较未处理组均显著增加, 同时对照组积累的MDA和H2O2高于转基因株系。由于STOP1蛋白中的锌指结构域高度保守, 即STOP1同源基因在调控植物铝抗性方面的进化是保守的, 同时FBXL在单子叶和双子叶植物中结构保守, 因此FBXL在调节STOP1同源基因进而参与调节植物铝抗性方面具有保守功能[24,28]。结合上述结果可以得出结论, 油菜在受到铝胁迫后, Bna-miR43对靶基因、进行切割, 导致其编码的FBXL蛋白降低, 减弱了FBXL对转录因子STOP1的泛素化降解, 使得过表达植株对铝胁迫表现出较高的抗性(图10)。

4 结论

本研究在甘蓝型油菜中鉴定到了Bna-miR43, 其靶基因为FBXL蛋白家族成员。Bna-miR43在甘蓝型油菜体内对靶基因FBXL进行切割, 降低其表达量, 可能减少了FBXL对转录因子STOP1的泛素化降解, 增强了对铝胁迫的抗性。

图10 Bna-miR43的可能作用途径

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附表1 Bna-miR43的前体和成熟体序列

Table S1 Bna-miR43 precursor sequence and mature sequence

Bna-miR43序列 Sequence (5¢-3¢) 前体序列Precursor sequenceAGTTTAGGTCGAAGATTGGAACATTGGGACCGTGCCCTATTACAAACTTACACACATTGCAAGCATATTTCTATGCTCATACATATGATCAATATAGCCTTCTATCTTAAGTCAAGTATTGTATAATTTAATTTTGTTATACACTAATTTAGATCATGAAGAGTCTGGATTTTTAGTTTTTTTTTCTACAAT 成熟体序列Mature sequenceGAAGATTGGAACATTGGGACC

Functional analysis of Bna-miR43-FBXL regulatory module involved in aluminum stress in

ZHANG Ying-Chuan1, WU Xiao-Ming-Yu1, TAO Bao-Long1, CHEN Li1,2, LU Hai-Qin1, ZHAO Lun1, WEN Jing1, YI Bin1, TU Jing-Xing1, FU Ting-Dong1, and SHEN Jin-Xiong1,*

1National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / National Engineering Research Center of Rapeseed, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China,2School of Advanced Agriculture and Bioengineering, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China

Aluminum is one of the main factors that limited crop growth and yield in acid soil and how to utilize acid soil is of great significance. This study is based on Bna-miR43, an unreported miRNA identified in the previous study. We analyzed the molecular characteristics, conserved structure, phylogenetic analysis, and the expression level of Bna-miR43 and its target genes in. The Bna-miR43 over expression vector was constructed to explore the molecular mechanism of Bna-miR43- FBXL module inin aluminum stress. 5'-RACE showed that Bna-miR43 actually cleavedand. Bioinformatics analysis revealed that the homologous gene ofandinwas, encoding E3 ubiquitin ligase contained F-box. The qRT-PCR indicated that the relative expression levels of Bna-miR43 and its target genes had a phenomenon of trade-off in different tissues ofand under transient treatment of aluminum stress. Aluminum treatment showed that the entire aerial part of the transgenic plant grew much better than control and accumulated less MDA and H2O2. Meanwhile, the aluminum accumulation in the root of transgenic plants was less than the control. In this study, these results may provide reference for the response of aluminum stress in.

L.; Bna-miR43; F-box; aluminum stress

10.3724/SP.J.1006.2023.24079

本研究由国家自然科学基金项目(31871654)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31871654).

沈金雄, E-mail: jxshen@mail.hzau.edu.cn

E-mail: yczhang612@163.com

2022-04-02;

2022-07-21;

2022-08-19.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1137.002.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).