四味黄连洗剂对白色念珠菌和近平滑假丝酵母菌抑菌作用研究及有效成分筛选

2023-03-22朱红高家荣魏良兵单莉

中医药临床杂志 2023年2期

朱红，高家荣，魏良兵，单莉

安徽中医药大学第一附属医院安徽合肥 230031

白色念珠菌（Candida albicans）是真菌中的一种，为条件致病菌，主要存在于消化道、皮肤和泌尿生殖道黏膜[1]。可引起浅表感染，但也可引起深度感染或危及生命的系统性感染[2]。近平滑假丝酵母菌（Candida parapsilosis）是一种可以引起侵袭性念珠菌病的真菌[3]，其感染的发病率在逐年升高，其主要存在于皮肤表面，而且很容易经医护人员的手在医院中传播。

四味黄连洗剂是安徽中医药大学第一附属医院（三级甲等医院）皮肤科多年临床经验方，处方由黄连、黄柏、黄芩及大黄四味中药组成，其组方合理、精炼，疗效显著，主治夏季虫咬皮炎、脓痱、脓疱疮等。方中黄连清热燥湿、泻火解毒；黄柏、黄芩清热燥湿；大黄泻下攻积，清热泻火，利湿退黄[4]。

四味黄连洗剂在临床应用中，对皮肤真菌感染存在较好疗效。为探究其药效成分及作用机制，本实验选择白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌两种致病真菌，采用微生物试纸扩散法（K-B法）药敏实验体外测定四味黄连洗剂对两种真菌代谢活性的影响，探讨四味黄连洗剂的有效单味药材并进行缺味验证实验；CLSI法测定优化后的四味黄连洗剂的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值；CLSI和Spot assay法测定盐酸小檗碱的最低MIC值及对近平滑假丝酵母菌细胞活性的影响，为四味黄连洗剂临床适应症提供实验依据。

材料

1 菌株

白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌（由安徽中医药大学第一附属医院检验科实验室分离，张昌峰副主任检验师鉴定）。

2 药物

空白药敏纸（实验室自制，紫外灯光下照射1h）；氟康唑药敏纸（批号：K1004，ROSCO）；苯甲酸钠（批号：C02201804002，武汉有机实业有限公司）；羟苯乙酯（批号：103620170101，湖南尔康制药股份有限公司）；黄连（批号：202100326）、黄芩（批号：20210410）、黄柏（批号：20210117）、大黄（20190402），安徽中医药大学第一附属医院中药房，经中药房韩光磊主任药师鉴定符合《中国药典》2020年版一部规定。盐酸小檗碱（批号：110713-201814，中国食品药品检定研究院）。

实验仪器

微生物分析鉴定仪（型号：VITEKZcomPACT，法国梅里埃）；麦氏比浊管仪（Densichek plus）；隔水式恒温培养箱（型号：GNP-9160，上海三发科学仪器有限公司）；数显恒温电热套（型号：SKM型，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司）；十万分之一电子天平（型号：BP211D，德国SARTORIUS公司）；MH琼脂培养基（批号：190321，江门市凯林贸易有限公司）；沙氏葡萄糖液体培养基（批号：3102267，广东环凯微生物科技有限公司）；高压灭菌锅（型号：YXQ-LS-75G，上海博讯事业有限公司医疗设备厂）；冰箱（型号：SC-609，澳柯玛股份有限公司）。

制备方法

1 四味黄连洗剂药敏纸的制备

取四味黄连洗剂10μl，在无菌环境下滴于置紫外线线照射1h后的空白药敏纸上，即得。

2 不同浓度单味药材溶液药敏纸的制备

按处方比例及制备工艺制备1：1的黄芩、大黄、黄连、黄柏提取溶液各100mL，分别取10mL浓缩至5mL得2：1比例的各供试品溶液；高压蒸汽灭菌后，取各溶液各10μL制成含药药敏纸。

3 缺味组方供试品溶液药敏纸的制备

按处方比例及制备工艺，分别制成缺大黄的供试品溶液、缺黄芩的供试品溶液、缺大黄和黄芩的供试品溶液，取各溶液各10μL制成含药药敏纸。

4 制剂辅料溶液药敏纸的制备

按处方比例分别称取羟苯乙酯和苯甲酸钠适量，加入适量水，高压蒸汽灭菌，各取10μL制成含药药敏纸。

5 阳性对照药敏纸

以氟康唑药敏纸为阳性对照。

6 空白对照药敏纸

取紫外灯光下照射1h后的滤纸圆片为空白对照药敏纸。

7 白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌菌液浓度

取临床实验白色念珠菌、近平滑假丝酵母菌菌株，用麦氏比浊管仪调整为0.5麦氏浓度的菌液，备用。

实验结果

1 四味黄连洗剂对白念珠菌丝、近平滑假丝酵母菌代谢影响[8-10]

采用微生物试纸扩散法（K-B法）观察四味黄连洗剂对白念珠菌丝、近平滑假丝酵母菌代谢影响。取三组药敏纸实验于分别涂布有白色念珠菌及近平滑假丝酵母菌琼脂的培养基上，置37℃恒温培养箱中培养24h观察菌株生长情况。

从图1我们可以看出，1、2药敏纸无抑菌圈出现，3药敏纸抑菌圈不明显，可见四味黄连洗剂体外对白色念珠菌抑菌效果较差；图2中1、2药敏纸抑菌圈明显，比3药敏纸的抑菌圈大；4药敏纸无抑菌圈，氟康唑对照组亦出现明显抑菌圈，可见在体外情况下四味黄连洗剂与氟康唑对近平滑假丝酵母菌有抑制作用。

图1 白色念珠菌K-B法药敏实验

图2 近平滑假丝酵母菌K-B法药敏实验

2 辅料抑菌作用

四味黄连洗剂中有羟苯乙酯、苯甲酸钠两种辅料添加剂，现对羟苯乙酯、苯甲酸钠抑菌作用进行实验如下：

在图3中，对这两种添加剂进行了抑菌效果的排除，1、2药敏纸均无抑菌圈出现，无抑菌作用，对四味黄连洗剂的抑菌效果无干扰。由此可知，四味黄连洗剂中的黄连、黄柏在原组浓度下体外有明显的抑制近平滑假丝酵母菌作用

图3 K-B法羟苯乙酯、苯甲酸钠体外抑菌实验

3 四味黄连洗剂中各药味对近平滑假丝酵母菌的体外抑菌作用

取各组药敏纸分别涂布有近平滑假丝酵母菌琼脂的培养基上，置37℃恒温培养箱中培养24h观察菌株生长情况。从图4可以看出2、3药敏纸抑菌圈明显，5药敏纸抑菌圈明显，但<2、3药敏纸，说明在同一浓度下，黄连、黄柏的体外抑菌效果较复方更好；4药敏纸无抑菌圈出现；1药敏纸先抑菌后菌落回涨显现，体外抑菌效果有限；由此可见，在四味黄连洗剂中，黄连、黄柏药味对体外近平滑假丝酵母菌有抑菌作用，为本制剂的有效抑菌药味。

图4 K-B法1：1浓度下各单味药材抑菌实验

由图5可知，3、4药敏纸抑菌作用增加，抑菌圈更明显；2药敏纸抑菌圈更明显；1、5药敏纸无抑菌作用，可见大黄、黄芩在1：1、2：1浓度下对体外近平滑假丝酵母菌均无抑菌效果。

图5 K-B法2倍浓度下各药味的抑菌实验

4 缺味四味黄连洗剂对近平滑假丝酵母菌菌落生长的影响

取各组药敏纸实验于分别涂布有近平滑假丝酵母菌琼脂的培养基上，置37℃恒温培养箱中培养24h观察菌株生长情况，如图6，在“4.2”中，我们确定了大黄、黄芩对近平滑家丝酵母菌无体外抑菌作用，故此次进行缺味实验进行处方优化。由图6可知，①药敏纸抑菌圈出现，但抑菌圈较小，抑菌效果有限。由此可见，缺少大黄的复方溶液抑菌效果下降，大黄虽无直接抑菌作用，但在复方中可能起重要的“佐”方作用；②药敏纸无抑菌圈出现，可见黄芩、黄柏与大黄三者的混合溶液有很好的抑菌作用；③药敏纸抑菌圈明显，抑菌作用较好，可见黄连、黄柏的混合溶液有较好的抑菌效果，应为本方的“君”药。

图6 缺味四味黄连洗剂对近平滑假丝酵母菌的抑菌试验

5 四味黄连洗剂的最低抑菌浓度

取0.5麦氏的近平滑假丝酵母菌菌液1000μL，加374mL沙氏葡萄糖液体培养基，震荡混匀浓度即为4*106，取混匀后的菌液1000μL，再加入999mL沙氏葡萄糖稀释为2*103。

取四味黄连洗剂，旋蒸成干粉，取1024μg溶于1mL蒸馏水中，按二倍稀释法稀释为512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL，取各浓度下溶液100μL，加入菌液100μL；在阳性对照管中加入100μL菌液；在空白对照管中加入营养肉汤培养液100μL。置37℃恒温培养箱中进行培养。

由图7 可知，16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml试管内发生混浊，有细菌生长，而 128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml试管内澄清透明，无细菌生长，所以四味黄连洗剂对近平滑假丝酵母菌的最低抑菌浓度为128μg/ml。由图可见，其MIC值较高，抑菌效果不理想，故继续探究其有效抑菌成分。由于在黄连和黄柏两味药材中，其主要成分为盐酸小檗碱，故选择盐酸小檗碱进行下一步实验。

图7 最低抑菌浓度（MIC）的测定

6 Spot assay 检测对盐酸小檗碱近平滑假丝酵母菌细胞活性影响[7-9]

取0.5麦氏浓度的近平滑假丝酵母菌细胞溶液，用 RPMI 1640 培养液稀释菌液至 4×103CFU/mL 备用。精密称取盐酸小檗碱4.096mg溶于10uL DMSO中，加入RPMI 1640培养基4mL，配制成质量浓度为1024μg/mL 的原液，倍比稀释质量浓度为512μg/mL、256 μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL，分别与同体积不同浓度的菌液混匀，菌液浓度分别为 2×105CFU/mL、2×104CFU/mL、2×103CFU/mL、2×102CFU/mL、2×101CFU/mL，各取 5μL点种于固体沙氏培养基上，在37℃恒温培养箱中培养48 h，结果见图8。