菊花-密蒙花药对治疗角膜损伤的作用机制*

陈惠媚 ，时健 ，王紫艳 ，汤钰 ，姚小磊

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 中医药防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重点实验室 湖南长沙 410208

3 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410208

角膜上皮层位于角膜浅层，虽再生能力强，但因其神经支配丰富，一旦损伤则会令患者十分痛苦。据调查显示，眼外伤约占所有急诊科就诊的3%，其中约80% 因角膜擦伤或异物就诊[1-2]。作为眼科中的一常见疾病，其临床表现主要为疼痛，流泪，异物感，眼部检查可见结膜红斑、眼睑肿胀、流泪和眼睑痉挛[3]。角膜损伤主要为角膜擦伤和异物，角膜穿孔、眼部烧伤等病因所致。目前临床上应用抗生素滴眼液对症治疗或手术治疗[4]，但上述治疗方式均停留于缓解患者症状层面，并未解决问题的根本[5]。

中医认为，菊花中富含丰富的黄酮类化合物，具有平抑肝阳，清肝明目的功效，这类成分是菊花被药用于降糖、脂以及消炎去火、清肝明目的最主要原因，在治疗肝经风热所导致的眼肿、眼痛、流泪等症状上，均有很好的疗效[6]。现代药理研究发现，菊花具有抗氧化、抗衰老的作用[7]。同时密蒙花清热凉肝、退翳明目、养肝明目之功效，常用于治疗暴风客热、白涩症、消渴目病[8]，在眼科中应用极为广泛。 二者均归于肝经，配伍使用能增强其清肝泻火、养肝明目的作用，是眼科诊疗中的一对常见配伍组合。然而，目前关于该药对的作用机制尚不明确。因此，本研究基于网络药理学与分子对接的角度，研究其配伍组合的作用机制，旨在更加准确地把握角膜损伤疾病的用药规律。

材料与方法

1 菊花-密蒙花活性成分的筛选及其靶点获取

选用中草药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），先后输入“菊花”及“密蒙花”，以药物口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18为标准，筛选出药物的有效成分及潜在作用靶点。最后使用Uniprot数据库与perl软件，将各个有效成分的作用靶点转换为gene symbol，并筛除无法匹配出gene symbol的靶点。

2 角膜损伤疾病相关靶点检索

在 GeneCards、Drugbank、OMIM、PharmGkb等疾病数据库以”Corneal injury”为关键词搜索得到角膜损伤的相关靶点，其中，在GeneCards数据库中以相关度评分（Relevancescore）≥1为筛选条件。将得到的疾病靶点与药物靶点取交集并绘制交集基因的Venn图，得到菊花-密蒙花治疗角膜损伤的潜在靶点。

3 药对-疾病-活性成分-靶点网络构建

借助 Cytoscape 3.9.0 软件，将上述潜在靶点及其对应的活性成分以及相关关系文件导入，构建药对-成分-靶点网络图。

4 PPI网络的构建及核心靶点的筛选

将潜在靶点导入String网络平台（https：//stringdb.org），物种设置为“Homo sapiens”，置信度设定为>0.9，同时隐藏游离的靶点，得到蛋白互作网络图。将节点关系信息保存，将其导入到Cytoscape软件进行分析、筛除以进一步明确治疗角膜损伤的核心靶点。

5 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

利用 Metascape（http：//metascape.org/）网络平台，将物种设置为 H.sapiens，对潜在靶点进行 GO 功能富集分析与 KEGG 通路富集分析，并将分析结果于微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）以气泡图及柱状图的形式绘制。

6 潜在活性成分与核心靶蛋白的分子对接

通过pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子配体，并保存为mol2格式。通过AutoDockTools1.5.6软件将配体保存为pdbqt格式配体参数文件。通过RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）下载蛋白受体的结构。利用PyMOL软件去除水分子和小分子配体。随后在Autodock软件中对受体进行加氢等处理。设置蛋白受体的口袋参数，调整活性口袋大小及其坐标位置，保存并输出参数文本文件后通过AutoDockVina进行分子对接，对接结果通过PyMOL软件进行可视化分析。

结 果

1 菊花-密蒙花主要活性成分及靶点

使用TCMSP数据库，检索得到菊花的有效成分为17个，密蒙花的有效成分为2个。对应的药物的作用靶点共2592个，其中菊花2359个，枸杞子233个。利用perl软件筛选出与有效成分相关作用靶点共586个，其中菊花502个，密蒙花84个。最后利用Uniprot数据库将靶点蛋白转换为gene symbol，并进行筛除，共得到药物靶点511个。

2 角膜损伤相关疾病靶点及菊花-密蒙花药对-角膜损伤交集靶点

根据 GeneCards、Drugbank、OMIM、PharmGkb数据库搜索出疾病的相关靶点并进行筛重，得到疾病的靶点共2797个（图1），取药物靶点与疾病靶点的交集共146个靶点作为药物作用的潜在靶点（图2）。

图2 药物与疾病交集venn图

3 “药物-成分-靶点”网络的构建

将菊花-密蒙花的潜在靶点与对应的活性成分以及相关关系文件导入导入 Cytoscape3.9.0 软件中，构建药物-成分-靶点网络图。其中椭圆形节点为基因节点，菱形靶点为成分靶点。基因靶点按照degree值排序得到图3。其中，椭圆靶点中，最外圈的degree值范围为0～1，中间圈的degree值范围为2～3，最内圈degree值范围为4～120，为最大。而成分靶点中，橘红色节点代表菊花，深红色代表菊花及密蒙花的交集成分。

图3 “药物-成分-靶点”网络图

表1 菊花-密蒙花主要活性成分

4 PPI网络的构建及核心靶点的筛选结果

选用STING网络平台，将置信度设定为>0.9并隐藏游离的靶点，构建PPI网络（图4）。结果包括130个节点，593条边，将靶点蛋白相互作用信息导入Cytoscape软件中，利用“CytoNCA”计算出各节点的介数中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、基于局部平均连通性的方法中心性（LAC）和网络中心性（NC），大于中位值则符合标准，经两次筛选之后，得到≥中位数的靶点蛋白有14 个（表2），并绘制出 PPI 网络条形图（图5）。

表2 根据DC排序产生的菊花-密蒙花治疗角膜损伤的核心靶点

图4 PPI蛋白网络互作图

图5 核心靶点的degree值水平条形图

5 GO基因富集分析

将潜在靶点导入Metascape网络平台，进行GO功能富集分析，共筛选得到1949个GO条目。其中包括 1680条生物过程（biologicalprocess，BP）、102条细胞组成（cellularcomponent，CC）和167条分子功能（molecularfunction，MF），将以上条目根据p值排序，分别取前10条于绘制柱状图及气泡图。（图6）其中，圆点大小代表富集到此通路的基因数目，颜色代表 P Value值，颜色越红，富集程度越显著。从生物过程分析，菊花-密蒙花治疗角膜损伤主要与无机物的反应、激素的反应、细胞因子的反应、细胞对脂质的反应及细胞对氮化合物的反应等相关。细胞成分主要涉及膜筏、膜微区、转录调节复合物、蛋白激酶复合物等。分子功能主要涉及DNA结合转录因子结合、转录因子结合、RNA聚合酶ⅱ特异性DNA结合转录因子结合及转录辅调节子结合等。

图6 GO富集分析结果

6 KEGG通路富集分析

在Metascape平台对核心靶点进行 KEGG 通路富集分析后，依据 P 值排序筛选出前 20 条通路。用气泡图及柱状图对以上通路进行绘制，见图7。图中纵轴代表富集的通路，点的大小代表核心靶点中富集到该通路的靶点个数，颜色代表p value值。结合文献可知，其中与治疗角膜损伤较密切的通路有：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt 信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞衰老等信号通路。

图7 KEGG富集分析图

7 菊花-密蒙花关键活性成分与核心靶蛋白的分子对接

选择上述4个关键靶点，在调控网络中进行小分子配体的筛选，分别查找到：JUN对应山柰 酚（kaempferol）、木 犀 草 素（luteolin）、槲 皮 素（quercetin）、β-谷 甾 醇（beta-sitosterol）；TP53对应刺槐素（acacetin）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）；MAPK1对 应 木 犀 草 素（luteolin）、槲皮 素（quercetin）、柚 皮 素（naringenin）；RELA 对应 刺 槐 素（acacetin）、异 鼠 李 素（isorhamnetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）；选取四者中共有的木犀草素（luteolin）及槲皮素（quercetin）作为药物活性成分，与核心靶点蛋白JUN（PDB ID：5T01）、MAPK1（PDB ID：1TVO）、 TP53（PDB ID：1A1U）和RELA（PDB ID：1NFI）进行分子对接。若结合能<0 kcal/mol，表明配体分子可以和受体蛋白自发地结合，若结合能小于-5.0 kcal/mol，表明两者具有较好的结合性（表3）。且结合能越小，对接越好，发生的作用可能性越大[9]。结果显示，各化合物与蛋白对接的结合能均<-5.6 kcal/mol，说明各化合物与各蛋白均能较好地结合。

表3 不同活性成分与核心靶蛋白结合能

图8 主要活性成分与JUN、TP53、MAPK1、RELA分子对接图

讨 论

角膜损伤在眼科中极为常见，目前，全世界有超过 1000 万人受到角膜失明的影响[10]。在临床上，角膜损伤会造成包括影响视轴的瘢痕形成、反复角膜糜烂、继发性青光眼、外伤性白内障、视网膜脱离和视力下降等多发后遗症[11-12]，因此，寻求治疗角膜损伤的一个有效方案显得尤为重要。而菊花、密蒙花以其清肝、养肝明目的功效，在中医诊疗中被广泛应用，并取得不斐的疗效。但关于该药对治疗角膜损伤的靶点和作用机制尚未清晰。

本研究运用网络药理学和分子对接的方法，发现该药对治疗角膜损伤的关键成分为木犀草素、槲皮素、柚皮素、山柰酚、刺槐素等黄酮类药物，结合文献可知，木犀草素具有显著的抗炎、抗氧化、抗病毒作用[13]。而同为黄酮类药物的槲皮素在抗炎、抗氧化、抗病毒等方面也发挥着不错的疗效[14]。另外，山奈酚被认为是最活跃和最重要的天然抗炎化合物之一，其抗炎作用强大，通过多种通路抑制炎症反应[10]，柚皮素在免疫炎症方面具有较好的作用[15]，而刺槐素通过抑制 NF-κB、MAPK 通路下调 TNF-α 和 IL-1β 的表达，从而发挥抗炎作用[15]。这些特性均可在角膜损伤的治疗中发挥作用，提示着上述成分能够促进角膜损伤修复。

PPI网络分析显示，degree值较高的几个靶点分别为 JUN、TP53、MYC、MAPK14、MAPK3、RELA、MAPK1及ESR1。其中，JUN蛋白可以根据不同的细胞类型决定诱导细胞凋亡或者抑制细胞凋亡[16]，MAPK信号转导通路对外界刺激具有较高的敏感性，同时参与了细胞凋亡的路径和组织修复的过程[17]，RELA 是 NF-κB 家族的重要成员，可精准调控 NF-κB 的转录活性，并在调节炎症、代谢及免疫应答等重要的生命活动中起重要作用[18]，TP53能诱导细胞周期阻滞、凋亡、衰老[19]，这提示这些靶点可能为菊花-密蒙花药对治疗角膜损伤的关键靶点。

通过富集分析可见，在生物过程方面，菊花-密蒙花药对治疗角膜损伤主要与无机物的反应、激素的反应、细胞因子的反应、细胞对脂质的反应及细胞对氮化合物的反应相关。菊花-密蒙花药对治疗角膜损伤的通路主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17 信号通路、TNF信号通路、细胞衰老等信号通路。结合文献可知，在AGE-RAGE信号通路中，TAGE（毒性AGEs）在凋亡/坏死事件中起作用，因此与细胞死亡和组织损伤有关。目前研究证实毒性AGEs（TAGE）的细胞泄漏通过AGEs受体（RAGE）影响周围细胞，从而导致细胞的损伤[20]，而PI3K-Akt信号通路是介导炎症介质和细胞因子分泌的主要通路[21]，IL17通路可通过直接或间接诱导多种炎症因子、趋化因子介导炎症反应[22]，TNF信号通路则能促进细胞凋亡，还介导炎性反应和调节免疫功能[23]，这些均与角膜损伤的炎症损伤发病机制存在密切联系。

接着，选取槲皮素、木犀草素与4个关键靶点——JUN、TP53、MAPK1及RELA等进行了分子对接，结合效果均较好，说明这两种化合物与核心靶点发生作用的可能性较大，这侧面证明了菊花-密蒙花药对可能通过木犀草素、槲皮素等成分作用于核心靶点，进而对角膜损伤疾病起到治疗作用。

综上所述，本研究借助网络药理学和分子对接的方法，对菊花-密蒙花药对治疗角膜损伤的作用机制进行了初步探讨，发现了其治疗角膜损伤的主要成分为木犀草素、槲皮素等黄酮类药物，并作用于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞衰老等信号通路而发生作用，这为菊花-密蒙花药对在眼科角膜损伤治疗中的中药配伍使用和作用机制的深入挖掘提供参考依据。