一株野生球盖菇的鉴定及其菌丝生物学特性研究初报

2023-03-22张泽乾

食用菌 2023年1期

张泽乾刘虹

（1山西农业大学，山西太原 030031；2山西农业大学山西功能食品研究院，山西太原 030031）

大球盖菇Stropharia rugosoannulataFarl.ex Murrill隶属于伞菌目Agaricales，球盖菇科Strophariaceae，球盖菇属Stropharia，是一种著名的大型真菌[1]，也是联合国粮农组织向发展中国家推荐栽培的食用菌之一，是一种重要的食、药用真菌。该菌味美色优，营养丰富，具有增强人体免疫力、降低血糖等保健及药用价值[2-6]。

我国野生球盖菇资源比较匮乏，从已有发表的关于野生球盖菇的报道来看，我国发现的野生球盖菇主要特征为红色、黄色或棕色，主要分布于我国台湾、陕西、内蒙古、甘肃、四川、云南等省区[7-10]。

研究对象为采自山西省太原市娄烦县云顶山的一株棕黄色野生大球盖菇，该物种个体中到大型，肉质肥厚。为了开发利用该野生资源，笔者在形态特征鉴定的基础上对其进行分子鉴定，并对该菌株进行生物学特性研究，以期为该野生菌株的驯化栽培、开发利用和后期规模化栽培提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）标本：野生球盖菇菌株（SP1），2020年9月采自山西省娄烦县云顶山海拔1 680 m（北纬37°52'43″，东经111°36' 06″）的栎树林草地，样本新鲜且无病虫害。组织分离法获得纯菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上纯化后，筛选出菌丝生长旺盛的菌株作为母种，现保存于山西农业大学山西功能食品研究院，编号HSA361。

（2）母种培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）粉46 g，蛋白胨3 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，蒸馏水1 000 mL；pH自然。

（3）平板培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，琼脂粉20 g，磷酸二氢钾3 g，硫酸镁1.5 g，维生素B10.03 g，硫酸铁0.1 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 形态学鉴定

以体视显微镜和手持放大镜观察子实体宏观特征，主要包括子实体、菌盖和菌柄的形状、颜色、表面有无鳞片以及菌褶的特征等；光学显微镜下观察子实体显微结构；以蒸馏水或3%KOH 制作水封片，用棉兰和Melzer 试剂检验担孢子壁是否喜蓝以及淀粉质反应[11-13]。

1.2.2 分子鉴定

提取目标样本（SP1）DNA，完成PCR 扩增，PCR扩增在FTGRAD2D 型PCR 扩增仪上进行，ITS 测序工作由北京中科希林生物技术有限责任公司完成。测序后ITS 基因序列通过BLAST 程序与GenBank 数据库中所收录的ITS 基因序列进行同源性比较核对，结合形态学特征对样本进行鉴定[13-14]。

1.2.3 碳源试验

以平板培养基为对照，分别以相当碳量的麦芽糖、果糖、蔗糖、甘露醇代替其中的葡萄糖，培养基按配方制备好后于121.3 ℃，灭菌20 min 后备用。将SP1 供试菌株接种到装有活化培养基（PDA）培养皿（直径90 mm）中央，于25 ℃暗培养10～12 d，挑选长势茁壮一致的菌落，在其边缘用完全灭菌的打孔器（直径6 mm）取生长一致的接种块移至供试碳源培养基培养皿中心，置25 ℃暗培养10 d。按照十字交叉法每隔3 d 用游标卡尺测量菌落直径，计算菌丝生长速度[15]，每个处理重复5 次。同时观察菌丝长势及菌落形态。

1.2.4 氮源试验

以平板培养基为对照，分别以酵母膏、牛肉膏、麸皮、硫酸铵、尿素代替其中的蛋白胨。每个处理重复5次。将试验菌株大小一致的菌种块接种到上述供试培养基中央，置25 ℃暗培养10 d 后，并观察菌丝长势，测定菌丝生长速度。操作方法同碳源试验。

1.2.5 碳氮比试验

以平板培养基中的葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，碳氮总量23 g，按照5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的碳氮比设置5 个处理，每个处理重复5 次。其他操作同碳源试验。

1.2.6 培养温度试验

将试验菌种接种在平板培养基中，培养温度设15 ℃、18 ℃、21 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃6 个处理，每个处理重复5次。其他操作同碳源试验。

1.2.7 培养基pH试验

在超净工作台上用1.0 mol/L NaOH 溶液和1.0 mol/L HCl 溶液调整PDA 平板培养基酸碱度[16]，共设pH5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 七个处理，每个处理重复5次。其他操作同碳源试验。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2003、SPSS、LSD 法进行数据处理和统计分析[17]。

2 结果与分析

2.1 形态学特征

标本担子果中到大型（图1）。菌盖幼时半球形，成熟后渐平展，幼时直径2.5～4.0 cm，成熟后5～12 cm，幼时灰褐色、褐色或黄褐色，成熟后变为浅黄色或黄褐色，表面有褐色鳞片，边缘有内菌幕残余。菌褶直生至弯生，灰紫色，渐变为褐色、灰褐色，较密，边缘灰白色。菌肉白色，伤不变色，厚达2 cm。菌柄中生，长4～10 cm，粗1.2～2.0 cm，圆柱状，或基部变粗成棒状，白色，表面有片状或棉絮状鳞片，鳞片易脱落以至于成熟后近光滑，早期中实，后内部渐松软，基部没有菌索。菌环常缺，如有为膜质或絮状，位于菌柄中上部。

图1 喜杨球盖菇Stropharia populicola生态照

担孢子椭圆形，（5.5～7.5）µm×（3.5～4.5）µm，褐色，表面光滑，具有一个退化的芽孔。担子柱棒状，（25～30）µm×（10～12.5）µm，4 孢子型，小梗短于1.5µm。缘囊体大量，（32.5～50）µm×（12.5～17.5）µm，棒状至近梭形，顶部有或没有短凸起，薄壁。子实层除担子外有3 种成分，（1）黄囊体，棒状或梨形，（27.5～32.5）µm×（7.5～12.5）µm，顶部有或没有短指状凸起，薄壁，内含黄色无定形物质；（2）侧生薄壁囊状体，罕见，大小为42.5µm×15.0µm，瓶形或近梭形；（3）棘状类囊体（acanthocyte），具6～13条放射状刺棘，长47.5µm，基部直径5µm，厚壁。子实层菌髓组织菌丝平行排列，菌丝无色，直径5～10µm。菌盖皮层组织菌丝无色或浅黄色，薄壁，直径5.0～7.5µm。菌盖表面鳞片有成束菌丝聚集而成，菌丝直径3.5～8.5µm，无色或淡黄色，薄壁。菌肉组织菌丝薄壁，无色，直径5～15µm。菌柄皮层菌丝平行排列，菌丝无色，薄壁，直径5～15µm。锁状联合罕见[18]。

2.2 分子比对结果

提取的SP1 菌株ITS 和nrLSU 片段在GenBank上比对结果（表1），来自中国山西省云顶山地区的野生球盖菇HSA361 经样本分子比对，结合形态学鉴定可以确定研究物种是喜杨球盖菇Stropharia populicola[18]。

表1 球盖菇（SP 1）样本及其GenBank比对结果

2.3 供试碳源对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

碳源是食药用菌生长所必不可少的营养物质[19]。由表2可以看出，供试碳源培养基对球盖菇（SP1）菌丝的生长势和生长速度会产生很大的影响。以葡萄糖为碳源的培养基上菌落呈圆形而完整，菌丝洁白、粗壮、浓密、生长势强，平均生长速度最快，为2.81 mm/d，显著快于其他碳源；碳源为甘露醇或麦芽糖表现次之，果糖表现最差，菌丝乳白色、稀疏，生长势弱，平均生长速度最慢，为1.76 mm/d。

表2 供试碳源对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

2.4 供试氮源对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

氮源是食用菌生长的第二大营养[20]。不同的氮源对球盖菇（SP1）菌丝生长势、平均生长速度影响显著（表3）。在以酵母膏为氮源的培养基上，球盖菇（SP1）的菌丝洁白，菌落形态椭圆形、完整、浓密、生长势最强，平均生长速度最快，为2.42 mm/d，对比其他氮源处理差异显著；氮源为蛋白胨、硫酸铵表现次之；尿素表现最差，菌丝仅在接种块周围生长甚至不生长。

表3 供试氮源对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

2.5 试验培养基碳氮比对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

由表4可以看出，球盖菇（SP1）菌丝在碳氮比为5∶1～25∶1 的培养基上均可生长，生长势和平均长速呈显著差异。在碳氮比为10∶1 的培养基上菌丝生长势最强，平均长速最快，为2.71 mm/d，与碳氮比5∶1、15∶1、20∶1、25∶1 差异显著；其次为碳氮比5∶1和15∶1，二者差异不显著，但与其他碳氮比菌丝生长速度差异显著；表现最差的为碳氮比25∶1，菌丝稀疏，生长势弱，生长速度最慢。

表4 试验培养基碳氮比对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

2.6 培养温度对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

由表5 可以看出，球盖菇（SP1）的菌丝在15～30 ℃培养均可生长，生长势和平均长速差异显著。菌丝生长最适宜的温度为25 ℃、21 ℃，生长势最强、平均长速最快，分别为2.58 mm/d和2.55 mm/d，与其他处理差异显著；当培养温度低于25 ℃时，菌丝平均长速随温度的升高呈逐渐加快的趋势，且生长势趋强；当培养温度高于25 ℃时，菌丝平均长速随温度的升高呈逐渐下降的趋势，且生长势趋弱。

表5 培养温度对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

2.7 培养基pH对球盖菇（SP1）菌丝生长的影响

由表6 可以看出，培养基pH 5.0～8.0 球盖菇（SP1）菌丝均可生长，且随着pH 的升高，菌丝平均长速呈现先升高后下降的趋势，以培养基pH 7.0、pH7.5 菌丝生长表现最好：菌丝生长势最强，平均长速最快，分别为2.69 mm/d、2.55 mm/d，菌落形态为椭圆形，形态完整，浓密，与其他pH 处理菌丝生长差异显著；pH6.0 及以下或pH 8.0 时，菌丝生长势弱，菌丝平均长速显著下降。