灵芝属9个野生菌株的分子鉴定与系统发育关系分析

胡 佳 戴 丹 彭新红 孙 鹏 王洪秀 陈绪涛 王 振 熊泽亚 魏云辉*

（1江西省农业科学院农业应用微生物研究所，江西南昌 330200；2江西省科学院生物资源研究所，江西南昌 330096）

灵芝属GanodermaP.Karst.隶属担子菌门Basidiomycota、伞菌纲Agaricomycetes、多孔菌目Polyporales、灵芝科Ganodermataceae，是分布广泛的一类大型食药用真菌[1]，是我国传统的中药材。灵芝富含三萜类化合物、灵芝多糖等多种药用成分，具有抗肿瘤、抗衰老、调节免疫力等生物活性[2]。我国的灵芝种质资源非常丰富，但是目前已经被开发利用的灵芝种类有限，灵芝栽培品种也比较混乱[3]。江西省野生灵芝属种质资源丰富，开展野生灵芝菌株的收集、鉴定和系统发育关系的分析，对于丰富灵芝属种质资源库，挖掘和开发优良灵芝菌株，选育优良灵芝新品种等都具有重要的意义。

真菌核糖体DNA（rDNA）的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）由于承受的进化压力较小，因此容易产生更多的变异，表现出广泛的序列多态性[4-5]，是目前真菌分类和鉴定的重要依据之一[6]。ITS 序列分析的方法广泛应用于真菌分类鉴定、系统发育等研究[7-10]。

基于ITS 序列测序与分析对9 个野生灵芝属菌株进行分子鉴定，并通过构建系统发育树，分析9个野生灵芝菌株与31 个国内栽培灵芝菌株间的系统发育关系，为野生灵芝属菌株的驯化栽培、新品种选育等工作提供参考依据，为今后的种质鉴定及遗传育种等研究提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

（1）供试菌株：研究菌株包括采自江西省的9个野生灵芝属菌株（表1），31 个国内栽培灵芝菌株（表2）作为对照组，1 个云芝菌株和1 个牛樟芝菌株作为外类群组（表3）。

表1 采自江西省的野生灵芝菌株

表2 试验收集栽培灵芝菌株

表3 外类群组菌株

（2）培养基：PDA 培养基，每1 000 mL 中含有200 g马铃薯，20 g葡萄糖和20 g琼脂粉，pH自然。

（3）主要试剂：植物基因组DNA 提取试剂盒DP305、2×Taq PCR 预混试剂（北京天根生化科技有限公司），DL2000 DNA Marker、TS-GelRed 核酸凝胶染料（北京擎科生物科技有限公司），引物（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 野生灵芝子实体采集、组织分离与菌种保藏

图1 供试灵芝G06菌株生境照

采集前记录野生灵芝生境，采集过程中保证野生灵芝子实体完整。选取新鲜子实体进行组织分离，用75%酒精消毒子实体表面后，用无菌手术刀剖开菌盖，取菌肉部分接种于PDA 培养基斜面，于28 ℃避光培养。待菌丝萌发后挑取无污染的尖端菌丝转接至PDA 斜面进行纯化培养，待菌丝长满斜面后保藏菌种。

1.2.2 菌丝培养和基因组DNA提取

从母种斜面挑取少量菌丝培养物接种至PDA平板上，28 ℃培养至菌丝长满平板。收集菌丝和提取基因组DNA 参照王洪秀等[7]方法，提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.2.3 ITS序列扩增

用真菌ITS 通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3' 和ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'[11]作为引物，对所有供试菌株的ITS 序列进行扩增。25µL PCR 反应体系如下：2×Taq PCR预混试剂12.5µL、引物ITS1 1µL、引物ITS4 1µL、DNA模板1µL、ddH2O 9.5µL。PCR程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 PCR产物测序与序列分析

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带后，交由上海生工生物工程有限公司纯化测序。测得的序列在NCBI 的GenBank 中进行Blast 比对，分析获得同源序列。在Clustal X 中进行多序列比对，切去两端不整齐的碱基，导入MEGA 7.0 中计算成对遗传距离，采用Kimura 2-parameter 模型，空位数据作为完全缺失（Complete deletion）处理，转换（Transition，Ti）和颠换（Transversion，Tv）的权重相同。最后以云芝（G41）和牛樟芝（G42）为外类群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML），构建系统发育树，基于Kimura 2-parameter 计算模型，经过1000次Bootstrap可信度分析。

2 结果与分析

2.1 ITS序列扩增结果

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带清晰（图2），长度在650 bp左右。

图2 供试灵芝菌株ITS序列电泳图

2.2 野生菌株同源序列分析

将9 个野生灵芝菌株的ITS 序列在GenBank 中比对，选择综合评分最高的同源序列（表4）。结果所有野生菌株均为灵芝属，其中G01 的同源菌株为紫芝Ganoderma sinense，G02、G03 的同源菌株为树灵芝Ganoderma sessile，G04 的同源菌株为南方灵芝Ganoderma australe，G05、G07、G08 的同源菌株为有柄灵芝Ganoderma gibbosum，G06、G09 的同源菌株为灵芝Ganoderma lingzhi。9个野生菌株的ITS序列提交至GenBank，登录号为OL744615-OL744623。

表4 野生灵芝菌株ITS序列在GenBank中的同源性比对结果

2.3 灵芝属菌株ITS序列分析

将40 个灵芝属菌株ITS 序列进行多序列比对，序列长度在576～595 bp，G+C（鸟嘌呤+胞嘧啶）含量在46.22%～49.66%（表5）。G+C 含量可以反映属种间的亲缘关系，不同物种的DNA 中G+C 含量不同，G+C 含量差异越大，说明其亲缘关系越远，反之则说明亲缘关系越近[4]。由表5 可见，灵芝属40 个菌株中G+C含量差异较大，说明亲缘关系较远。

表5 灵芝属40个菌株的ITS序列长度和G+C含量

灵芝属40 个菌株ITS 序列的变异统计见表6。在ITS 序列中有438 个保守位点（Conserves sites），163 个变异位点（Variable sites），106 个简约信息位点（Parsimony-informative sites）以及57 个自裔位点（Singleton sites），变异率为27.03%，说明灵芝群体间的差异较大。转换/颠换（R）值为2.12，转换多于颠换，这与之前的报道结论相一致[12]。

表6 试验灵芝属40个菌株ITS序列的变异情况

2.4 系统发育分析

以外类群组中G41、G42 以及从GenBank 下载的云芝（KY628331.1）和牛樟芝（MK764937.1）ITS 序列作为外类群，对9个野生灵芝菌株、对照组中灵芝属31 个栽培菌株以及8 个来自GenBank 的灵芝属ITS 序列进行聚类分析，构建系统发育树（图3）。由系统发育树可以看出，除外类群G41（云芝Trametes versicolor）和G42（牛樟芝Antrodia camphorata）各自分为两类组外，灵芝属菌株（G01—G40）聚为9 个类组，第一类组：野生菌株G06 与栽培菌株G13、G14、G16、G17、G22、G23、G24、G26、G31、G36 聚为一组，由ITS 序列在GenBank 中进行同源性比对可知，G06应为灵芝Ganoderma lingzhi，与我国大部分栽培菌株亲缘关系较近；第二类组：栽培菌株G10、G12、G15、G25、G34、G38、G40 聚为一组；第三类组：野生菌株G09 与栽培菌株G33 聚为一组，说明二者的亲缘关系较近；第四类组：G30 独自为一组，与灵芝Ganoderma lingzhi（MN372059.1）亲缘关系较近；第五类组：栽培菌株G11、G18、G39 与亮盖灵芝Ganoderma lucidum（JQ520176.1）聚为一组；第六类组：野生菌株G02、G03 与栽培菌株G19、G28、G29、G37 聚为一组，与树灵芝Ganoderma sessile（MG654317.1）亲缘关系较近；第七类组：栽培菌株G32 单独为一组，与亮盖灵芝Ganoderma lucidum（KX262903.1）亲缘关系较近；第八类组：野生菌株G01 与栽培菌株G20、G21、G27、G35 以 及 紫 芝Ganoderma sinense（MH106882.1）聚为一组；第九类组：野生菌株G04、G05、G07、G08 聚为一组，与南方灵芝Ganoderma australe（JX195205.1）、有柄灵芝Ganoderma gibbosum（MZ823626.1）亲缘关系较近。试验灵芝属40个菌株亲缘关系差异较大，遗传背景较丰富。

图3 基于ITS序列构建的系统发育树

3 小结与讨论

由于真菌种类繁多，个体多态性明显，且个体形态易受生态环境及其他因素的影响，因此仅仅依靠传统的形态鉴定还不够准确。ITS1 和ITS2 属于中度保守区段，表现为种间差异较明显，而种内相对一致的特点，而且这种鉴定方法允许少量的错配或序列分析误差。因此，ITS 序列分析是真菌物种分子鉴定的有效手段，也适于属内种间或种内差异较大的菌株间系统发育关系的分析，是传统形态鉴定方法的重要补充[13-15]。研究基于ITS 序列分析对江西省9 个野生菌株进行分子鉴定，确定9 个菌株均为灵芝属，将9 个野生灵芝菌株中的灵芝、紫芝、南方灵芝、树舌亚属等类组区分开来，并通过构建系统发育树分析野生菌株与栽培菌株之间的亲缘关系。

对9 个野生灵芝属菌株的鉴定与分类，有助于更好地对其评价与利用。其中野生紫芝G01，有着较大的开发潜力，后期可以开展G01 菌株的驯化栽培工作，与现有的紫芝栽培品种进行产量、药用成分、商品性的比较试验，挖掘其优良性状，为紫芝的品种选育提供基础材料。灵芝Ganoderma lingzhi是我国主要的栽培品种[16]，对G06、G09开展驯化，可丰富灵芝的栽培品种。虽然关于南方灵芝栽培的报道较少，但已有研究表明南方灵芝中含有多种萜类化合物、生物碱[17-18]和免疫调节蛋白[19]等药用成分，具有抗氧化、α-糖苷酶抑制等活性[20]，可对G04进一步开展生物学特性、药用价值等研究。综上所述，ITS 序列分析为野生灵芝菌株的鉴定、分类以及种质资源评价等提供理论基础，为野生灵芝种质资源的开发利用提供参考依据。

但是，ITS 序列分析的准确性受数据库中的核酸信息是否准确、是否完善影响，存在一定的局限性。在今后的研究中，可开展ITS、TEF1-α 和LSU等多基因分析，并与ISSR、RAPD、SRAP[21]、InDel[22]等多种分子标记相结合，进一步研究灵芝的遗传多样性。同时从栽培特性、农艺性状和药用成分等角度开展灵芝种质资源评价，为灵芝种质资源开发利用提供更丰富的理论依据。