2019—2021 年食品微生物能力验证的结果分析与讨论

李文绮，李自芹，贾文婷

（1. 石河子质量与计量检测所，新疆石河子 832000；2. 新疆农垦科学院农产品加工研究所，新疆石河子 832000）

0 引言

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌广泛分布于自然界中，极易污染空气、水源、食物等，均是引起细菌性食物中毒的病原菌，也是人兽共患病原菌，可导致人和动物的多种疾病，严重危害人体的健康[1-3]。我国GB 29921—2021《食品安全国家标准 预包装食品中致病菌限量》[4]和GB 31607—2021《食品安全国家标准 散装即食食品中致病菌限量》[5]均要求：涉及食品生产加工环节、经营销售环节，都应采取相应措施降低食品中致病菌的含量。其中，GB 29921—2021 涉及的13 类食品，5 类中规定了单核细胞增生李斯特氏菌的限量、8 类中规定了金黄色葡萄球菌的限量、13 类中规定了沙门氏菌的限量[4]；GB 31607—2021 涉及的3 类散装食品，1 类中规定了单核细胞增生李斯特氏菌的限量、3 类中均规定了沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的限量[5]。由此可见，这几类致病菌分布之广，尤其是沙门氏菌，居所有致病菌首位，具有极大的安全隐患。

菌落总数和大肠菌群是国内外通用的食品污染常用指示菌，是评价食品卫生状况的重要指标，长期食用菌落总数和大肠菌群超标的食物会危害人体健康[6-7]，故各地监管部门将其列为食品安全监控的常规项目。

因此，对上述微生物的准确检测具有重要的意义。能力验证是体现实验室检测能力和实现实验室质量控制的有效手段，尤其是在微生物检验中。因此，本机构每年申请参加一定数量的微生物能力验证活动，现将2019—2021 连续3 年的能力验证情况报告如下，以期给同类检测机构一些参考和指导。

1 材料与方法

1.1 测试样品

连续3 年能力验证测试样品见表1。

表1 连续3 年能力验证测试样品

1.2 仪器与试剂

仪器：JE3002 型电子天平（0.01 g），上海浦春计量仪器有限公司产品；DZKW-D-6 型电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司产品；Tal boys 型旋涡混合器，美国公司产品；PHS-3C 型酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；YXQ-LS-50S Ⅱ型和YXQ-LS-70A 型立式压力蒸汽灭菌器（2 台）、BSC-1300 ⅡA-B3 型生物安全柜、SPX-150B-Z 型生化培养箱、3 台BSP-150 型生化培养箱（灭菌锅、生物安全柜和培养箱），上海博迅实业有限公司医疗设备厂产品；OLYMPUS BX41 型生物显微镜，日本奥林巴斯株式会社产品。

试剂：0.85%的无菌生理盐水（氯化钠AR），天津市致远化学试剂有限公司提供；缓冲蛋白胨水（BPW），广东环凯微生物科技有限公司提供。

微生物能力验证测项目所需试剂见表2。

表2 微生物能力验证测项目所需试剂

1.3 检验方法

依据GB 4789 规定的相关微生物项目和测试试样附带的参试指导书的要求进行检测。

能力验证测试样品检验方法见表3。

表3 能力验证测试样品检验方法

1.4 检验步骤

测试样品的前处理均严格按照附带的参试指导书进行，每个试验做3 组空白对照（无菌室和生物安全柜环境监测、生理盐水空白对照、培养基空白对照） 各2 个平皿。

1.4.1 沙门氏菌检测

从制备的样品原液中取25 mL，加入到225 mL BPW 中，充分涡旋混匀，于36 ℃条件下培养16 h后，分别取1 mL 样品匀液接种于10 mL 的TTB 增菌液和10 mL 的SC 增菌液中，将TTB 增菌液于42 ℃、SC 于36 ℃下培养23 h 后，分别划线转种BS 平板（36 ℃培养47 h） 和沙门显色平板（36 ℃培养23 h）后挑取典型的菌落进行生化鉴定。

1.4.2 金黄色葡萄球菌检测

从制备的样品原液中取25 mL，加入到0.85%灭菌盐水225 mL 中，旋涡混匀，制成10-1的样品匀液，再吸取10-1的样品匀液1 mL，加入到生理盐水9 mL 中，重复上述操作，逐级稀释成10 倍系列梯度的样品匀液。每个稀释度分别取0.3 mL，0.3 mL，0.4 mL 涂布3 块BP 平板，于36 ℃条件下培养46 h，详细记录每个平板的菌落数。挑选典型的菌落分别做染色镜检和血凝试验；同时划线接种血平板（于36 ℃下培养22 h） 后观察菌落形态。

1.4.3 菌落总数检测

从制备的样品原液中取25 mL，加入到0.85%灭菌盐水225 mL 中，旋涡混匀，依次制作10-1~10-8的样品匀液，每个稀释梯度（包括样品原液） 各取1 mL样液加入到平皿内（不少于2 个平皿）。及时取琼脂培养基18~20 mL 倾注平皿，充分混匀，待琼脂凝固后再覆盖一层约4 mL 培养基（防止菌落蔓延、造成计数不准）。待完全凝固后，将培养皿倒置于36 ℃生化培养箱中培养46 h，选择典型的菌落计数。

1.4.4 单核细胞增生李斯特氏菌检测

取25 g 制备的样品，加入到225 mL 的LB1 增菌液中混均匀，于30 ℃下培养23 h 后，吸取0.1 mL 转种于10 mL 的LB2 增菌液中，置于30 ℃下培养20 h，取培养液画线接种显色平板和PALCAM 平板，36 ℃培养28 h，挑取可疑菌落接种木糖和鼠李糖发酵管，同时画线接种TSA-YE 平板，均于36 ℃下培养20 h后，选择木糖-、鼠李糖+的纯培养物继续进行生化鉴定。

1.4.5 大肠菌群检测

从制备的样品原液中取25 mL，置于0.85%灭菌生理盐225 mL 水中，旋涡混匀，依次制作10-1~10-6的样品匀液，每个稀释梯度（包括样品原液） 各取1 mL 样液加入到平皿内（不少于2 个平皿）。及时取琼脂VRBA 18~20 mL 倾注平皿，充分混匀，同2.4.3进行覆盖。待完全凝固后，将平皿倒置于36 ℃生化培养箱培养45 h，选择典型的菌落计数。同时接种BGLB 管，于36 ℃条件下培养36 h，产气的肉汤管对应大肠菌群阳性。

2 结果与分析

3 组空白对照均无菌落生长。

2.1 沙门氏菌

2 个样在BS 平板和显色平板上均有可疑菌落生长，各挑取2 个可疑菌落进行生化鉴定。

沙门氏菌生化鉴定检测结果见表4。

表4 沙门氏菌生化鉴定检测结果

2.2 金黄色葡萄球菌

BP 平板和血平板上均有可疑菌落生长，详细记录每个梯度的菌落数，同时从BP 平板挑取10 个可疑菌落进行鉴定，染色镜检、血平板培养、BHI 培养、血浆凝固酶试验均为阳性。

金黄色葡萄球菌检测结果见表5。

表5 金黄色葡萄球菌检测结果

2.3 菌落总数（2020 年和2021 年）

2020 年2 个样品的结果均偏小。2021 年2 个样品的结果均为满意。

连续2 年的样品菌落总数检测结果见表6。

表6 连续2 年的样品菌落总数检测结果

2.4 单核细胞增生李斯特氏菌

20-P928 样在PALCAM 平板上有小的灰绿色圆形菌落生长，在李斯特菌显色平板上有大的乳白色菌落生长，挑取纯培养的2 个可疑菌落进行鉴定。20-E866 样在PALCAM 平板和李斯特菌显色平板上，均无菌落生长。

单核细胞增生李斯氏菌特检测结果见表7。

表7 单核细胞增生李斯氏菌特检测结果

2.5 大肠菌群

选取15~150 CFU 的平板计数紫红色的典型菌落，20-J492 样10-3稀释度平板上10 个菌落均产气；20-L017 样10-1稀释度平板上10 个菌落均产气，进行大肠菌群检测。

大肠菌群检测结果见表8。

表8 大肠菌群检测结果

3 结论与讨论

实验室参加的5 项能力验证结果评价均为满意，其中菌落总数首次结果不满意，2020 年的2 个样品的检测结果均偏小，经过分析，主要存在3 个方面的原因：一是倒平板时未进行覆盖，菌落生长过程中出现蔓延，导致计数出现误差；二是对蔓延的菌落计数不规范，造成数值偏小；三是对标准理解不透，选取了菌落数在30~300 CFU 范围蔓延生长的平板进行计数，导致计算公式选用错误，结果偏低。针对以上原因，立即采取了纠正措施，该项目通过再次参加能力验证取得了满意的结果。

实验室通过对2019—2021 年参加的微生物能力验证项目进行分析，总结出如下注意事项和质控点，供相关的微生物实验室参考。

3.1 样品接受、制备、稀释环节

（1） 样品接受。实验室应随时关注样品寄送情况，及时接受。接到样品后，首先应检查样品性状和包装情况，确认样品无异样后方可开展检验。若不能立即检测，应严格按照参试指导书要求的环境温度先行保存，防止样品中原有微生物的状况发生变化[13]。

（2） 样品制备。样品制备应严格依据随样参试指导书的要求进行，尤其是定量检验的微生物项目，西林瓶中的样品是一个不可分割的整体，应确保尽可能充分地转移到稀释液中。

（3） 样品稀释。能力验证的样品复杂多样，无法预估其污染的状况，样品稀释过程尽可能多制备几个稀释梯度，一般不少于6 个，且每步操作均应量取准确。

3.2 菌落培养、分离、挑取环节

无论是定性检验还是定量检验，增菌、分离和纯化培养的步骤尤其重要。选择实验室常用的增菌液和特异性分离培养基有助于目标菌的检出和计数。分离培养时建议使用多种培养基双重选择，对菌落形态典型、显色的选择培养基优先选用，以便有效地分离到目标菌。平板划线应尽可能地分离出单个菌落，定性项目的生化试验和血清学试验选择营养琼脂上纯培养的细菌进行，定量项目在计数时应详细记录典型的菌落数，进行后续鉴定时，应尽可能多地挑取可疑菌落，以确保取到目标菌，防止挑取的全部是杂菌而造成假阴性的结果。

3.3 结果分析、处理、报告环节

试验操作过程的每一步结果均应详细记录下来，方便出现问题时查找原因、采取纠正措施。定性检验项目要严格依据标准规定的鉴定方法进行，不能减少步骤，除了常规的生化鉴定，还应配合对应微生物的特征反应进行染色镜检、血清学鉴定、血浆凝固酶试验、溶血试验等，综合多重鉴定结果，确认无误后报告样品中检出或未检出目标菌。定量检验项目中典型菌落计数和确认是关键所在，国标中规定的培养时间一般是最长生长时间，试验中发现很多微生物菌落通常在规定的培养时间之前已能明显计数，针对这种情况，应隔一段时间观察菌落的生长情况，并做好记录，防止过早计数，漏掉生长缓慢的菌落；也要防止过晚计数，避免一些容易蔓延生长的菌落过度生长，相互覆盖，影响计数结果。

综上所述，微生物检测中的每个环节都关系到最终的检测结果，能力验证是监控各个实验环节的有效手段，它能充分暴露实验室在检测环节中存在的问题，指导实验室建立相应的预防措施和纠正措施，维持实验室的质量体系有效运行。尤其是微生物能力验证，因其多是阳性样品，整个试验操作不但能够锻炼和提升检验人员的技术能力和水平，而且能够体现微生物实验室的检测能力，是有效实现实验室质量控制的重要手段。