基于荧光原位杂交技术的全自动病理染色系统结构设计

林成旭 甘 浪 谭鑫平 李雪梅 闫 旺 李 倩 陈 刚廖广兰 刘智勇

1.华中科技大学机械科学与工程学院，武汉，430000 2.武汉康录生物技术股份有限公司，武汉，430000

0 引言

受人口老龄化影响，我国恶性肿瘤的发病率不断上升[1-2]。2022年国家癌症中心报道的最新数据显示，2016年肺癌和乳腺癌分别是我国男性人群和女性人群中发病率最高的癌症，相较于2010年分别提高了约32%和46%[3-4]。在发病率上升的同时治愈率也在不断提高，主要原因在于癌症诊断相关技术的不断进步，人们能够更早地发现癌症病灶，并予以适当的治疗[5]。近年来分子细胞遗传学发展迅速，荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术是一种在分子水平上检测核酸序列的有效方法，并在乳腺癌[6]、淋巴瘤[7]、膀胱癌[8]诊断、治疗与研究等领域有广泛应用。

FISH实验的关键步骤在于组织样本预处理、杂交及染色，此过程需要使用多种实验仪器和试剂，人工实验操作繁琐且极易出错[9]。在杂交阶段，根据使用的探针试剂或检测需求不同，通常需杂交16 h以上[10-11]，人工开展FISH实验将大量消耗人力物力资源，检测效率受到了极大的限制。随着自动化和智能化技术的快速发展，国内外相关研究团队提出了采用自动化病理染色系统来代替人工。国内团队多是针对免疫组化技术研发染色设备，如福州迈新生物技术开发有限公司推出的“Titan”、厦门通灵生物医药科技有限公司推出的“Aliya”等，而针对FISH技术的自动化染色设备研究尚少。国外最具代表性的团队有德国Leica、美国BioGenex等，二者推出的自动病理染色仪支持包括FISH技术在内的多种染色技术。但是用户使用后发现，前者仍为半自动设备，需手动盖盖玻片及揭盖玻片，一定程度上需要人员值守；后者反应仓底部为非密封结构，在使用过程中存在反应仓试剂泄漏、试剂量不准确等问题，导致染色效果不理想。因此，面向FISH技术的自动病理染色系统还存在自动化程度不足、功能不完善等问题。

本研究以全自动病理染色系统的机械结构为研究对象，参考手工FISH实验的基本流程，分析染色过程所需的基本操作，利用SolidWorks和AutoCAD软件设计染色系统的机械结构，依托自动化控制系统实现FISH实验的全自动进行。本设计解决了上述染色系统存在自动化程度不足、染色效果不理想等问题，具有工作效率高、功能集成度高、染色质量好、发展潜力大、适用样本种类多等优点，显著减轻了人员劳动强度，实现了我国针对FISH技术的全自动化染色系统从无到有的突破，推动了FISH实验的标准化和全自动化发展进程，具有重要的临床应用价值。

1 总体设计

1.1 总体布局

设计研究的一种全自动病理染色系统的机械结构主要由运动模块、夹具模块、辅助模块等部分组成。其中，运动模块包含多轴操纵臂、试剂加样器等，夹具模块包含载玻片夹具、盖玻片夹具等，辅助模块包含取样平台、电气控制柜等。三维结构如图1所示，取样平台1是承接系统机械运动及可供用户操作的平台，取样平台后方的电气控制柜2中布置了系统控制单元和驱动单元，取样平台上方支承了系统核心工作组件多轴操纵臂3，它主要对放置在载玻片夹具4中的病理切片进行滴样、盖盖玻片和揭盖玻片等操作，待使用的盖玻片放置在盖玻片夹具5中，系统工作过程中所需的生物试剂主要由试剂加样器6添加至病理切片上。

1.取样平台 2.电气控制柜 3.多轴操纵臂 4.载玻片夹具 5.盖玻片夹具 6.试剂加样器图1 总体结构示意图Fig.1 Overall structure diagram

1.2 工作原理

通过FISH技术处理病理切片有如下11个详细步骤：烤片、脱蜡、洗涤、通透、水处理、酶消化、脱水、变性、杂交、洗脱和染色，涉及试剂滴加、盖盖玻片、揭盖玻片、载玻片控温、载玻片干燥等基本操作，本系统需要模拟人工对病理切片的处理，即需实现上述基本操作的机械化和自动化。

试剂滴加可分为大量试剂(如酒精、脱蜡剂、洗涤剂)滴加及微量试剂(如通透剂、探针、荧光染料)滴加，大量试剂由蠕动泵或气泵快速喷出，微量试剂由微量注射泵精确滴加；待使用的盖玻片由盖玻片夹具夹持，多轴操纵臂中的吸盘轴利用真空吸附原理吸取盖玻片；载玻片温度由载玻片夹具中的加热装置进行控制；载玻片干燥通过升温和提高空气流速来实现，将载玻片夹具升温可提高试剂蒸发速率，气泵提供高速气流排空大部分试剂，残留的少量试剂由风筒吹干。

2 机械结构设计

2.1 运动模块

2.1.1多轴操纵臂

多轴操纵臂由多个运动轴构成，是本系统的核心部件，它直接对病理切片进行机械化和自动化的操作，主要完成精确定位病理切片、载玻片吹干、移液枪头提取、盖盖玻片、揭盖玻片等操作。操纵臂的布局和结构如图2所示，建立空间笛卡儿坐标系，X轴和Y轴为独立单轴，Z轴为三复合轴。自动化设备中常用步进电机作为驱动单元，并搭载同步带或丝杠螺母实现圆周运动向直线运动转化[12-13]。同步带具有传动承载能力高、噪声低、振动小等优点，丝杠螺母具有传动精度高、刚性好、微进给性好、结构紧凑等优点。X轴和Y轴采用同步带和直线导轨滑块的传动形式，在满足使用工况的情况下减小系统噪声。Z轴运动精度要求较高，且Y轴的悬臂结构限制了Z轴的体积和质量，因此Z轴采用丝杠螺母的传动形式，在保证传动精度和微量进给的情况下提高运动轴刚性。

图2 多轴操纵臂3D结构图Fig. 2 3D structure diagram of multi axis control arm

X轴安装在取样平台上，带动Y轴和Z轴组件沿X方向定点运动。该组件除了必要的结构零件外，还承载了若干步进电机、气泵、注射泵等，整体质量较大，在沿X轴运动的过程中易发生绕Y轴的旋转，运动误差较大，因此本设计使用了双滑块的单滑动导轨，通过增加X轴方向的支撑点来保证组件运动的精度和平稳性，同时提高X轴承载能力。此外，在X轴两端设计有行程开关和橡胶限位块，可实现软件层面和硬件层面的双重保护，防止因人为误触或机械故障等因素而导致的X轴超程事故。

Y轴采用悬臂梁结构，尽可能为用户提供一个开放的操作空间。Y轴带动Z轴组件定向运动，为了平衡Y轴正方向上Z轴组件的载荷，在Y轴负方向一侧设计了一个平台，用于放置气泵、注射泵、平衡块等零件。Y轴下端设计了四个喷气口，喷气口与气泵相连，用于反应结束后排空载玻片上的试剂。喷气口轴线与载玻片夹角约为70°，喷出的压力空气将形成气流屏障，气流屏障为试剂提供沿Y轴负方向的推动力，当喷气口缓慢向Y轴负方向移动时，试剂将被推至夹具排水口端，从而将试剂排出夹具，如图3所示。载玻片与夹具之间残余的试剂(如脱蜡剂、通透剂、蛋白酶、洗涤液等)可通过多次滴加并浸泡去离子水或无水乙醇去除，最后对夹具适当升温将水或无水乙醇蒸发即可。

图3 试剂排空原理示意图Fig.3 Schematic diagram of reagent emptying principle

Z轴是复合轴，分为Z1、Z2、Z3三个运动轴，具有功能多、结构简单紧凑、体积较小、运动精度高等优点。Z1轴主要用于提取和丢弃移液枪头。本设计统一采用容积为200 μL的枪头，在满足正常吸取试剂的前提下，提高Z轴的紧凑性和通用性。提取装置具有一定锥度，且略大于枪头锥度。提取枪头时，提取装置向枪头 移动，枪头锥面受力发生微小弹性形变，提取装置与枪头之间通过静摩擦力锁紧，同时摩擦面具有一定的气密性，以保证后续顺利抽取微量试剂。丢弃枪头时，Z1轴移动至丢弃装置中，丢弃装置的卡槽将枪头卡紧，提取装置沿Z轴负方向移动克服静摩擦力，实现枪头的丢弃。Z2轴主要操作盖玻片，包括抽取盖玻片、盖盖玻片、揭盖玻片等。Z2轴的轴端固定有橡胶吸盘，通过吸盘的真空吸附力将盖玻片吸牢，搭配X轴和Y轴的运动将盖玻片送至预定的位置，然后气泵对吸盘充气释放盖玻片，从而完成上述对盖玻片的操作。为了防止盖玻片因水浮作用而漂移，本设计的Z2轴可向下移动，使得盖玻片贴近载玻片，从而抑制盖玻片的漂移。本系统使用两种规格盖玻片(1号：22 mm×22 mm，2号：24 mm×50 mm)。1号盖玻片主要用于覆盖探针，探针黏度大且试剂量极少(约10 μL)，盖玻片几乎不会发生漂移。2号盖玻片用于覆盖样本区的通透剂，受反应盒尺寸限制，其漂移量不大于2 mm，且因其面积较大，仍能完全覆盖样本区。Z3轴主要对载玻片夹具进行操作，其轴端设置有弹性压头，压头作用在载玻片上，提供一个向下的复位压力，防止揭盖玻片后载玻片被抬起而脱离载玻片夹具的加热表面，影响后续步骤的温度控制。

2.1.2试剂加样器

试剂加样器分为微量试剂加样器和大量试剂加样器。本设计中的微量试剂是指一次喷出量小于200 μL的试剂，大量试剂是指一次喷出量大于1 mL的试剂。

受试剂生产规格及使用成本的影响，微量试剂加样误差需控制在1 μL以内，因此，微量试剂加样器选用最大注射量为200 μL且最小分辨力为0.1 μL的微量注射泵。微量注射泵通过管路与Z1轴枪头提取装置相连，微量试剂瓶统一放置在取样平台上。微量试剂加样主要步骤为：①Z1轴提取枪头；②X和Y轴联动将枪头移动至试剂瓶上方；③Z1轴将枪头插入微量试剂瓶；④注射泵动作吸取定量试剂；⑤Z1轴抬起枪头；⑥X和Y轴联动将吸有试剂的枪头移动至加样区；⑦注射泵排出试剂完成加样。微量注射泵使得加样精准可控，多轴联动使得移动快速准确。

大量试剂加样器有直接泵出式和间接泵出式两种。直接泵出式由蠕动泵提供压力，直接抽取试剂瓶中的试剂。蠕动泵出口通过管路与多轴操纵臂下端的喷液口相连，喷液口对准载玻片上的组织样本区，蠕动泵旋转即可将试剂喷射到样本区，另外在管路中还配置了快速接头，便于试剂瓶快速拆装。根据实验需求，本设计共有六组直接泵出式试剂加样器。

间接泵出式由气泵提供压力，间接挤出密闭容器中的试剂，如图4所示。压力气泵通过进气口向试剂瓶通入一定量的空气，当瓶内空气压强大于瓶外大气压强时，试剂将通过出液口被挤出。间接泵出式要求试剂瓶具有良好的装配性和气密性。本设计在试剂瓶口对称设置了两个楔形凸起，相对应地在瓶盖上设置了两个楔形滑槽，试剂瓶在滑槽内逆时针旋转30°～60°即可完成装配，沿相反方向转动即可完成拆卸，拆装简单便捷。气密性由密封圈来保证，瓶盖内衬一个特制的环形橡胶密封圈，密封圈的内侧面与试剂瓶口外壁相匹配，以实现试剂瓶口的侧面密封。相比于顶面密封的方式，侧面密封一方面可以防止因3D打印端面不平而造成的密封不良问题，另一方面可以减小楔形凸起与滑槽间的摩擦力，减少零件磨损，延长使用寿命。

(a)加样原理 (b)剖面结构图4 间接泵出式试剂加样器结构示意图Fig.4 Structure diagram of indirect pump outreagent sampler

2.2 夹具模块

2.2.1载玻片夹具

为了便于自动化处理病理切片，载玻片在本系统中应具有唯一且确定的位置，可通过设计载玻片夹具来实现。载玻片夹具是对病理切片定位并夹紧的机构，本系统设置了12个载玻片夹具(即12个工位)。载玻片夹具为独立结构，各工位之间互不干扰，具有温度可控、无试剂泄漏和操作方便等优点，主要由夹紧头、反应盒及发热片等构成，如图5a所示。

反应盒是载玻片夹具的主体，是本系统发生生物反应的主要场所。反应盒由铜合金或航空铝合金等具有良好导热性能的材料机加工而成，其表面涂镀一层聚四氟乙烯，以提高反应盒的耐腐蚀性，同时保证其良好的导热性。反应盒底部贴有电阻或半导体发热片，用于达到不同反应步骤所需的温度条件，其控温精度为0.1 ℃。反应盒底部完全密封，无试剂泄漏问题，能长时间保存反应试剂，保证反应持续进行。病理切片放置在反应盒内，它在X方向和Y方向上的位置精度应小于0.5 mm，通过控制反应盒内侧特征尺寸的精度即可保证。

(a)3D示意图

夹紧头用于病理切片的夹紧，图5b为夹紧头结构示意图。夹紧头基体上开有通孔，夹紧按键可在其内上下滑动，按键上端通过复位弹簧与基体相连。夹紧按键外部开有环形槽，基体侧面开有水平槽，环形槽与解锁按键的头部相匹配，解锁按键可在基体水平槽内滑动。夹紧按键内部开有阶梯孔，压头可在其内上下滑动。压头下端压装了压片，二者之间为过盈配合，压片可以减小压强且防止复位时按键飞出。压片与病理切片直接接触，传递夹紧力。压头上端通过夹紧弹簧与堵头相连，调节堵头旋入的深度即可调节夹紧力。当夹紧按键被按下时，解锁按键在压缩弹簧的作用下卡入滑槽内，限制夹紧按键复位，复位弹簧和夹紧弹簧均被压缩，达到夹紧的目的。当解锁按键按下时，头部移出滑槽，夹紧按键在复位弹簧和夹紧弹簧的作用下向上弹起，达到松开的目的。本设计为一键夹紧及一键松开结构，操作方便快捷。夹紧力由压缩弹簧提供，恒定且可调。

2.2.2盖玻片夹具

盖玻片的定位和夹紧通过盖玻片夹具来实现，两种规格的盖玻片所使用的夹具结构相同，仅尺寸不同，夹具结构如图6所示。夹具体通过底部螺钉与取样平台相连，具有确定的位置。夹具体底部开有导向孔，推杆可在孔中上下移动。推杆上端连接推板，盖玻片被整齐地码放在推板上，在弹簧的作用下，推板产生一个向上的推力，使得最上方的盖玻片始终贴紧顶部限位块，保证抽取盖玻片的位置一致。顶部限位块在靠近抽片方向开有一窄缝，控制窄缝宽度，使得最多允许一片盖玻片通过。抽片时吸盘吸紧最上方的盖玻片，吸盘移动时盖玻片与窄缝会产生相互作用，分离多余盖玻片，并抽取出一片盖玻片。盖玻片极薄(0.19～0.23 mm)，而系统工作腔内湿度往往大于70% RH(相对湿度)，普通盖玻片放置在夹具内极易发生吸潮粘连。盖玻片粘连后，在通过窄缝时往往会发生盖玻片与吸盘滑移、一次抽取两张盖玻片、盖玻片无法通过、盖玻片碎裂等异常情况，从而导致抽取失败。本设计采用了一种表面带涂层的防粘盖玻片，其表面涂覆了疏水材料，在工作腔内几乎不发生粘连，抽片成功率大于99%。本盖玻片夹具具有结构简单、抽片成功率高、操作方便等优点。

图6 盖玻片夹具结构示意图Fig.6 Structural diagram of cover glass holder

在通透、变性、杂交等反应过程中，需使用微量试剂，且需要加热病理切片。升高温度会加速试剂水分蒸发，使得试剂浓度发生较大变化，甚至出现病理切片烤干的现象，从而影响反应正常进行，导致最终处理效果不佳。因此，在上述过程中需要在样本区盖上盖玻片，减少水分蒸发。在通透过程中，反应所需温度高(高于80 ℃)，需进一步采用矿物油密封，在滴加完通透剂后Z1轴更换枪头并吸取120 μL矿物油，沿载玻片外侧白色方框绘制连续油路，随后采用2号盖玻片覆盖，实现密封样本，维持反应正常进行。而对于大量试剂(如乙醇、脱蜡剂等)，其用量大且反应时间短，故不需要盖玻片密封。

2.3 辅助模块

取样平台是辅助模块的主要部件，它主要起到存储和连接的作用。取样平台上存放了待处理的病理切片、染色过程所需的移液枪头、盖玻片及微量试剂等，连接了多轴操纵臂、电气控制柜等，因此在台面上对应留有相应的安装位置和连接法兰。染色过程中，为防止试剂交叉污染，使用过的移液枪头及盖玻片需及时丢弃，因此在取样平台上分别设计有对应的丢弃孔位，实验产生的废液经平台右侧的废液孔流至废液桶内，并在实验结束后分类处置。

电气控制柜主要用于电能分配和电路保护。电气控制柜中主要包括加热控制箱、系统控制板、电机驱动器、信号处理单元和电源适配器等。加热控制箱实现对12个载玻片夹具独立控温。系统控制板实现对系统工作流程的逻辑控制。电机驱动器用于对系统使用的各轴电机、真空泵和蠕动泵等进行运动控制。信号处理单元用于读取系统传感器输出的信号并做出相应的预处理。电源适配器用于变换及稳定电压并为整个系统供电，除此之外还配备了短路、过载等保护模块。根据各模块的电气连接属性，合理布局电气控制柜，设计了相关的安装及连接结构。

3 系统测试

通过机械加工、3D打印技术等制作机械结构零件，同时引进部分自动化零部件，结合自动控制技术，装配及调试各功能模块，得到图7所示的全自动病理染色系统样机。对系统的多轴操纵功能、试剂加样功能、夹持定位功能等进行测试。多轴操纵臂能够准确定位操作对象，定位误差不大于±0.1 mm；Y轴气嘴往复运动2次即可排空载玻片残余试剂，5 min内即可烘干载玻片；Z1轴能准确提取及丢弃移液枪头，准确率大于99.5%；Z2轴抽取盖玻片成功率大于99%，并能完成盖盖玻片和揭盖玻片的动作。试剂加样器能够准确响应所需的试剂类型，微量试剂加样误差不大于0.6 μL，大量试剂加样误差不大于0.5 mL。载玻片夹具操作便捷，最大控温110 ℃且控温误差不大于±1 ℃。测试结果表明，本系统的各模块均可正常工作，系统功能满足设计需求，能够全自动完成FISH实验的基本操作。

图7 全自动病理染色系统样机Fig.7 Prototype of automatic pathologicalstaining system

利用本系统开展FISH实验。经过长时间的实验流程和参数优化，本系统能够得到良好的染色效果，在荧光显微镜下可判读率超过90%。选用合适的组织样本和生物试剂(如通透剂、蛋白酶、快速探针等)，实验所需试剂均由武汉康录生物技术股份有限公司提供。在表1所示条件下完成FISH实验，使用100倍荧光显微镜得到图8所示的结果，可以看出，本系统处理的病理切片荧光图像对比度高、信号点清晰可见、酶消化程度良好、荧光染色均匀，满足病理判读要求。

表1 关键实验步骤及其条件

(a)红色荧光图 (b)绿色荧光图

将本系统与现有自动化染色系统的部分功能进行比较，如表2所示，可以看出，本系统在机械尺寸、反应仓温度控制范围、试剂保持效果和自动化程度上有明显优势。除此之外，本系统还能对细胞和尿液样本进行染色，更换控制程序及对应试剂等参数后亦可用于免疫组化实验。

表2 本系统与现有染色系统功能对比

4 结语

本研究针对现有染色系统存在的不足，参考人工荧光原位杂交(FISH)实验的操作过程，设计优化了相关的机械化操作结构：首先，设计了机械运动模块，模拟人工实验的相关动作，可实现试剂滴加、盖盖玻片、揭盖玻片等功能；其次，设计了夹具模块，可实现载玻片和盖玻片准确定位、载玻片控温及干燥、分离盖玻片等功能；最后，设计了辅助模块，可实现物品存储、模块连接、控制系统保护等功能。装配并调试优化各功能模块，搭载自动控制系统，实现了FISH实验的全自动进行。实验结果表明，本系统滴样误差小于1 μL、定位误差不大于±0.1 mm、载玻片温度控制误差不大于±1 ℃、抽取盖玻片成功率大于99%、无试剂泄漏，可实现高效全自动病理切片处理，无需人工干预，最终染色效果良好，可判读率大于90%，临床应用和市场发展潜力大。